HPLC法测定藤梨根中异秦皮苷的含量

马秉智，周宇，赫军，赵铁，李淑芳（中日友好医院药学部，北京 100029）

藤梨根为猕猴桃科植物中华猕猴桃Actinidia chinensis Planch.的干燥根，具有清热解毒、活血散结、祛风利湿之功效，可用于治疗风湿性关节炎、淋巴结结核、跌打损伤、痈疖等[1]。现代研究表明，其对胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、大肠癌均有作用[2]。郭洁等[3]报道藤梨根提取物对人胃癌BGC-823细胞的增殖具有明显抑制作用，在试验浓度范围内呈浓度依赖性，可促进细胞凋亡。孙春霞等[4]报道含有藤梨根的“化浊解毒方”可降低模型裸鼠血管内皮生长因子（VEGF）、环氧合酶-2（COX-2）的表达，联合用药疗效更佳。关于藤梨根的质量标准研究，邸学等[5]对藤梨根药材进行了高效液相色谱（HPLC）指纹图谱及质量研究，并测定了其中熊果酸、齐墩果酸的含量[6]，但是它们的含量均不超过0.1%。还有滕坤等[7]测定了藤梨根中大黄素的含量，但其含量仅为6.30μg/g。为此，笔者通过研究藤梨根的化学成分[8]，发现了其中一个含量较大的成分——异秦皮苷，而且是从猕猴桃科中首次分离得到。本研究将其作为质控指标，并采用HPLC法对藤梨根药材进行含量测定，为藤梨根的质量控制提供科学依据。

1 材料

LC-10A型HPLC仪（日本岛津公司）；BSA4235-CW电子天平（德国赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

异秦皮苷对照品（中日友好医院自制，纯度＞98%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

藤梨根分别购自北京华邈中药工程技术开发中心,产地:四川，产品批号:209061，生产日期:2012年9月6日；北京卫仁中药饮片厂，产地:浙江，产品批号:113612101，生产日期:2012年6月4日；北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司，产地:河北，生产批号:001003287，生产日期:2010年9月6日。经中日友好医院中药库唐永和药师鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物软枣猕猴桃Actinidia chinensis Planch.的根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18（250mm×4.6mm，5 μm），C18预柱（4.0mm×3.0mm）；流动相:乙腈-1%乙酸溶液（8∶92，V/V）；流速:1.0ml/min；检测波长:350nm；柱温:25 ℃；进样量:10μl。色谱见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取异秦皮苷对照品9.90mg，置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取样品粉末1.0 g，精密称定，置于100ml圆底烧瓶中，加入甲醇25ml，称定质量，回流提取30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 空白对照溶液的制备

精密移取甲醇25ml，置于100ml圆底烧瓶中，按供试品溶液的制备方法制成空白对照溶液。

2.5 线性关系考察

图1 高效液相色谱图A.空白对照；B.对照品；C.供试品；1.异秦皮苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.negative control；B.control；C.test sample；1.isofraxoside

分别精密移取对照品溶液0.5、1、2、4、8ml至10ml量瓶中，加甲醇定容。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到异秦皮苷的回归方程为y＝14893x+1289.5（r＝0.9999）。结果表明，异秦皮苷质量浓度在9.9～156.4μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

分别精密吸取同一异秦皮苷对照品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，异秦皮苷峰面积的RSD为1.5%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

分别精密吸取同一供试品溶液10μl，分别于放置0、2、4、6、8、10、12h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，异秦皮苷峰面积的RSD为1.3%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

分别取同一样品（批号:001003287）适量，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，异秦皮苷含量的RSD为1.0%，表明本方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的河北产藤梨根样品（批号:001003287）约0.50 g，共6份，分别加入一定量的异秦皮苷对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 样品含量测定

分别取不同产地的3批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以外标法计算样品中异秦皮苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

3 讨论

3.1 提取方法的选择

笔者考察了甲醇超声提取10、20、30min和甲醇回流提取30、60min 5种提取方法。结果发现，甲醇回流提取30min，测得的异秦皮苷的含量最高，故最终确定甲醇回流提取30min作为本研究的提取方法。

3.2 检测波长的选择

分别将异秦皮苷对照品溶液在200～800nm波长范围内作全波长扫描，发现其在350nm波长下有最大吸收，因此选择350nm作为本研究的检测波长。

3.3 流动相的选择

分别将甲醇-1%醋酸、甲醇-1%甲酸、乙腈-1%醋酸作为流动相，按不同比例进行研究。最终发现，采用乙腈-1%醋酸（8∶92，V/V）为流动相时，基线平稳，峰形、分离度效果较佳。

3.4 关于异秦皮苷的研究

笔者查阅近年来国内外文献发现，有关异秦皮苷的报道[9]很少，且主要是化学成分方面的研究。但是，它是否具有药理活性、是否是藤梨根的活性成分，尚有待于进一步研究。

[1]北京市药品监督管理局.北京市中药饮片炮制规范:2008年版[S].北京:化学工业出版社，2008:107.

[2]龙凯花，王小平，白吉庆，等.中药藤梨根抗肿瘤研究[J].中国现代中药，2013，15（10）:846.

[3]郭洁，王小平，白吉庆.藤梨根提取物对人胃癌BGC细胞凋亡及Bax蛋白表达的影响[J].亚太传统医药，2014，10（13）:12.

[4]孙春霞，李佃贵，闫翠环，等.化浊解毒方对裸鼠人胃癌原位移植瘤VEGF与COX-2的影响[J].中国药房，2012，23（19）:1735.

[5]邸学，王海波，杨欣欣，等.藤梨根药材HPLC指纹图谱及质量研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）:135.

[6]邸学，王海波，翟延君，等.HPLC测定藤梨根中熊果酸、齐墩果酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（1）:66.

[7]滕坤，于思文.高效液相色谱法测定藤梨根中大黄素的含量[J].通化师范学院学报:自然科学版，2014，35（3）:42.

[8]赫军，马秉智，赵铁，等.藤梨根的化学成分研究[J].中国药学杂志，2014，49（3）:184.

[9]刘宏伟，姚新生，王乃利，等.长柄七叶树的化学成分[J].中国天然药物，2005，3（6）:350.