HPLC法测定二仙汤提取物中抗骨质疏松有效成分的含量Δ

许红涛，李 媛，何勇静，袁婷婷，张乃丹，张巧艳#（1.福建中医药大学药学院，福州 350108；.第二军医大学药学院生药学教研室，上海 00433）

二仙汤收载于《中医方剂临床手册》中，由淫羊藿、仙茅、知母、关黄柏、当归和巴戟天6味中药组成，具有温肾益精、滋阴降火的双重调节功能，临床上用于治疗妇女更年期综合征和骨质疏松症[1-2]。为了明确二仙汤的活性物质基础，笔者以成骨细胞和破骨细胞为模型，对二仙汤水提物进行了抗骨质疏松活性成分的导向分离，以去卵巢骨质疏松大鼠为模型，对所获得的有效成分进行了抗骨质疏松的作用验证，明确二仙汤中的淫羊藿黄酮、知母皂苷和黄柏小檗碱为其抗骨质疏松的有效成分[3]。随后，又进一步以黄酮、知母皂苷和小檗碱为指标，优化了二仙汤的提取方法和抗骨质疏松部位的制备方法。为此，笔者建立了采用高效液相色谱（HPLC）法测定二仙汤提取物中抗骨质疏松主要有效成分淫羊藿苷、小檗碱和知母皂苷含量的方法，为质量控制提供科学依据。

1 材料

Cary 50紫外可见分光光度计（美国瓦里安公司），LC-10AD HPLC仪，包括SCL-10A自动进样器、SPD-10A检测器、LC-10AD泵、Chrom Spirit Perfect工作站（日本岛津公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子水。

淫羊藿苷（批号：110737-201311，纯度≥98%）、盐酸小檗碱（批号：110713-201212，纯度≥98%）、菝葜皂苷元对照品（批号：110744-201310，纯度≥98%）均由中国食品药品检定研究院提供。

淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、巴戟天和知母购于上海华宇药材公司，经第二军医大学药学院张巧艳副教授鉴定，符合2010年版《中国药典》（一部）的要求。经测定，淫羊藿中淫羊藿苷的质量分数为2.1%，黄柏中小檗碱的质量分数为0.683%，知母中皂苷类成分的质量分数为6.07%。

2 方法与结果

2.1 二仙汤提取物的制备

按照处方称取药材饮片，混合后，加50%乙醇提取3次，合并提取液。提取液减压浓缩至密度为1.05～1.10 g/ml，即为上柱样品液。将样品液按1倍柱体积上样量加入装有ZTC-1型大孔吸附树脂的色谱柱中，依次用12倍量水、8倍量50%乙醇和10倍量95%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩成浸膏，60 ℃干燥，得棕褐色粉末，即为二仙汤提取物。

2.2 淫羊藿苷的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），保护柱：Dikma Easy Guard C18（8 mm×4 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1%醋酸（60∶40，V/V）；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；流速：1.0 ml/min。

理论板数按淫羊藿苷峰计应不低于1 500。对照品溶液与供试品溶液在相同位置处有吸收峰出现，而阴性对照品溶液无此峰出现，表明阴性对照品溶液不干扰测定。色谱见图1。

图1 淫羊藿苷高效液相色谱图A.阴性对照品；B.淫羊藿苷对照品；C.供试品；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatograms of icariinA.negative control；B.icariin reference；C.test sample；1.icariin

2.2.2 对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷70.0 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取“2.1”项下二仙汤提取物约10 mg，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混匀，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液 以同样的提取制备方法，制备缺淫羊藿药材的二仙汤阴性对照提取物样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 线性关系考察 精密称取淫羊藿苷对照品25.0 mg，置于25 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每1 ml含淫羊藿苷1.0 mg的贮备液。精密量取贮备液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml，置于10 ml量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，摇匀，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μl，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得淫羊藿苷回归方程为y＝13 123x+31.885（r＝0.999 8）。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在40.00～90.00 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 最低定量限 以信噪比大于10计算淫羊藿苷的最低定量限约为1.00 μg/ml。

2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.5”项下淫羊藿苷对照品溶液（70.00 μg/ml），按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积的RSD为0.51%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取二仙汤提取物适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、1、2、4、6、8 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积的RSD为2.02%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取二仙汤提取物适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果，淫羊藿苷含量的RSD为0.99%，表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 取已知淫羊藿苷含量的样品，共6份，精密称定，加入等量的淫羊藿苷对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 淫羊藿苷加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of icariin（n＝6）

2.2.11 淫羊藿苷含量测定 取3批样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按外标法计算样品中淫羊藿苷的含量，结果见表2。

表2 淫羊藿苷含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of icariin（n＝3）

2.3 盐酸小檗碱的含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），保护柱：Dikma Easy Guard C18（8 mm×4 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.3%三乙胺水溶液（20∶10∶70，V/V/V，磷酸调节pH为4.0）；检测波长：340 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μl；流速：1.0 ml/min。理论板数按盐酸小檗碱峰计应不低于3 000。对照品溶液与供试品溶液在相同位置处有吸收峰出现，而阴性对照品溶液无此峰出现，表明阴性对照品溶液不干扰测定。色谱见图2。

2.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 ml含盐酸小檗碱20 μg的溶液，作为对照品溶液。

图2 盐酸小檗碱高效液相色谱图A.阴性对照品；B.盐酸小檗碱对照品；C.供试品；1.盐酸小檗碱Fig 2 HPLC chromatograms of hydrochloride berberinA.negative control；B.berberin hydrochloride reference；C.test sample；1.berberin hydrochloride

2.3.3 供试品溶液的制备 取“2.1”项下二仙汤提取物约10 mg，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混匀，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性对照品溶液 以同样的提取制备方法，制备缺关黄柏药材的二仙汤阴性对照提取物样品，按“2.3.3”项下方法制备，即得。

2.3.5 线性关系考察 精密称取盐酸小檗碱对照品10.0 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每1 ml含盐酸小檗碱1.0 mg的贮备液。精密量取贮备液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 ml，置于10 ml量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，摇匀，按“2.3.1”项下色谱条件进样20 μl，记录峰面积。以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得盐酸小檗碱的回归方程为y＝24 106x－5 917.2（r＝0.999 9）。结果表明，盐酸小檗碱质量浓度在5.00～35.00 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.6 最低定量限 以信噪比大于10计算盐酸小檗碱的最低定量限约为1.00 μg/ml。

2.3.7 精密度试验 取“2.3.5”项下盐酸小檗碱对照品溶液（20.00 μg/ml），按“2.3.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.93%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取二仙汤提取物适量，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、1、2、4、6、8 h时按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.58%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 取二仙汤提取物适量，共6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。结果，盐酸小檗碱含量的RSD为1.63%，表明本方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验 取已知盐酸小檗碱含量的样品，共6份，精密称定，加入等量的盐酸小檗碱对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品，按“2.3.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3 盐酸小檗碱加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test of berberin hydrochloride（n＝6）

2.3.11 盐酸小檗碱含量测定 取3批样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按外标法计算样品中盐酸小檗碱含量，结果见表4。

表4 盐酸小檗碱含量测定结果（n＝3）Tab 4 Results of content determination of berberin hydrochloride（n＝3）

2.4 知母皂苷的含量测定

2.4.1 测定方法 取“2.1”项下二仙汤提取物约0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入2 mol/L盐酸20 ml，回流3 h，用60 ml氯仿分3次（10、20、30 ml）回流萃取，每次20 min；收集氯仿层，回收至干，残渣用氯仿溶解并定容至50 ml，吸取1.0 ml，用氯仿稀释至10.0 ml，混匀，即得供试品溶液。另取菝葜皂苷元对照品，加氯仿制成每1 ml含菝葜皂苷元100 μg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液及对照品溶液各2.0 ml于具塞试管中，25 ℃水浴中吹干溶剂，分别加入5%香草醛冰醋酸0.2 ml和高氯酸0.8 ml，涡旋10 s混匀，于70 ℃水浴中放置20 min；取出后立即置冰水浴中冷却2 min，分别加入9.0 ml冰醋酸，混匀；以试剂为空白，按紫外-可见分光光度法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅤA]规定，在（590±2）nm波长处测定吸收度，计算所得值乘以2.16，即得。

2.4.2 线性关系考察 精密称取菝葜皂苷元对照品，用氯仿配制成1 ml含菝葜皂苷元0.20 mg的溶液，分别精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml于10.0 ml具塞试管中，按“2.4.1”项下方法进行样品处理和测定。以菝葜皂苷元质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得菝葜皂苷元的回归方程为y＝77x－1.625 4（r＝0.999 5）。结果表明，菝葜皂苷元质量浓度在8.00～40.00 μg/ml范围内与吸收度呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验 取同一对照品溶液（24.00 μg/ml），按“2.4.1”项下方法连续测定6次。结果，菝葜皂苷元吸光度的RSD为1.06%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份样品，按“2.4.1”项下制备供试品溶液，分别在0、20、40、60、90 min时进行测定。结果，菝葜皂苷元吸光度的RSD为1.52%，表明供试品溶液经显色反应后在90 min内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 分别精密称取二仙汤提取物共6份，按“2.4.1”项下方法连续测定。结果，菝葜皂苷元含量的RSD为1.69%，表明本方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 在已知知母皂苷含量的样品中加入定量菝葜皂苷元对照品，按“2.4.1”项下方法测定，计算加样回收率，结果见表5。

表5 知母皂苷加样回收率试验结果（n＝6）Tab 5 Results of recovery test of timosaponin（n＝6）

2.4.7 知母皂苷含量测定 取3批样品，按“2.4.1”项下方法测定样品中知母皂苷的含量，结果见表6。

表6 知母皂苷含量测定结果（n＝3）Tab 6 Results of content determination of timosaponin（n＝3）

3 讨论

淫羊藿是二仙汤处方中的君药，淫羊藿苷为其主要的化学成分。研究表明，淫羊藿苷能够减缓去卵巢骨质疏松大鼠的骨丢失，促进成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性的提高和骨矿化结节的形成[3-5]，抑制破骨细胞的骨吸收[6]。知母、黄柏具有协同处方中温补肾阳的淫羊藿、仙茅和巴戟天的作用，使其更好地调节机体机能。知母皂苷能够减轻去卵巢骨质疏松大鼠的骨丢失，促进成骨细胞的形成和分化[3]。小檗碱是黄柏的主要成分，对于去卵巢和地塞米松诱导的骨丢失具有显著的保护作用，能够显著抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收[3，7-8]。

应用HPLC法可测定淫羊藿苷的含量，但是二仙汤作为中药复方，其所含化学成分比单味药材淫羊藿的成分复杂得多，也与含淫羊藿的其他中药方剂不同[9]。本文通过优化色谱条件，以甲醇-1%醋酸（60∶40，V/V）为流动相，在270 nm波长下检测，取得了较好的分离效果，具有简便迅速的优点。

小檗碱属于生物碱类成分，研究中考察了不同的流动相体系、三乙胺的用量及pH，最终确定流动相为甲醇-乙睛-0.3%三乙胺水溶液（20∶10∶70，V/V/V，磷酸调节pH为4.0）时，可较好地解决色谱分离中的拖尾问题。

知母皂苷为二仙汤主要的皂苷类成分，由于该类成分没有紫外吸收，《中国药典》采用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法测定知母皂苷BⅡ的含量，以控制知母药材的质量。也有文献采用液相-质谱联用测定知母皂苷类成分的含量[10-11]。这些方法对仪器要求较高，难以普及。知母皂苷元的主要成分为菝葜皂苷元，其能与香草醛发生显色反应，基于这一原理，可通过测定知母皂苷的水解产物菝葜皂苷元的含量，来测定知母皂苷的含量。本研究通过优化皂苷水解时间、显色反应的温度和时间，获得了稳定、可靠、简便的二仙汤中知母皂苷类成分的含量测定方法。

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