邻苯二甲醛柱前衍生化HPLC法测定复方制剂中盐酸赖氨酸的含量

张 亿，朱 蓉，郑 萍，熊 玲（成都市食品药品检测中心，成都 610045）

盐酸赖氨酸为人体必需的8种氨基酸之一，具有刺激胃蛋白酶与胃酸的分泌、增进食欲、提高钙的吸收及其在体内的积累、加速骨骼生长的作用。其常与其他维生素组成复方制剂，用于调节幼儿新陈代谢、促进生长与发育[1]。因此，建立这类复方制剂中盐酸赖氨酸含量的测定方法，有利于更加严格地控制制剂的质量，保证用药安全。目前，复方赖氨酸制剂已有的质量标准多采用甲醛滴定法[2-3]或茚三酮比色法[4-7]，但这两种方法的专属性和精密度均不够高，仅适合于含单一赖氨酸成分且浓度较高的样品。考虑到复方制剂中辅料和其他成分都可能会对赖氨酸成分的测定造成干扰，且赖氨酸含量较低，笔者采用了高效液相色谱（HPLC）法，并以邻苯二甲醛（OPA）试剂对盐酸赖氨酸进行柱前衍生化，这样不仅解决了盐酸赖氨酸无发色基团、在紫外检测器下无特征吸收的问题，而且通过自动进样系统实现了被分析样品衍生后的在线分析，方法简便、快速，无需配置特殊衍生设备。

1 材料

1260 HPLC仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、带二级管阵列的紫外检测器（美国Agilent公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

盐酸赖氨酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：140624-200805，纯度：100%）；五维赖氨酸颗粒（批号：120925，规格：每克含盐酸赖氨酸50 mg、维生素B11.2 mg、维生素B20.15 mg、维生素B60.075 mg、烟酰胺2.4 mg、泛酸钙0.15 mg、枸橼酸0.09 mg）、赖氨肌醇维B12口服溶液（批号：130605，规格：每毫升含盐酸赖氨酸60 mg、维生素B123 μg、肌醇10 mg）、赖氨酸磷酸氢钙片（批号：1306071，规格：每片含盐酸赖氨酸100 mg、磷酸氢钙100 mg）均为日常监督抽检样品；OPA为美国Agilent公司市售产品（将邻苯二醛与3-巯基丙酸混合于硼酸盐缓冲液中）；甲醇、乙腈为色谱纯，硼酸钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯，水为Millipore超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 盐酸赖氨酸对照品溶液 取盐酸赖氨酸对照品约100 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加水溶解并稀释制成每1 ml中含1 mg盐酸赖氨酸的对照品贮备液；精密量取上述对照品贮备液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀释制成每1 ml中含0.2 mg盐酸赖氨酸的对照品溶液。

2.1.2 五维赖氨酸颗粒供试品溶液（S1）取五维赖氨酸颗粒1 g，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度；精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀释制成每1 ml中含0.2 mg盐酸赖氨酸的供试品溶液。

2.1.3 赖氨肌醇维B12口服溶液供试品溶液（S2）取赖氨肌醇维B12口服溶液1 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀释至刻度；精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含0.24 mg盐酸赖氨酸的供试品溶液。

2.1.4 赖氨酸磷酸氢钙片供试品溶液（S3）取赖氨酸磷酸氢钙片10片，研细，精密称取约相当于50 mg盐酸赖氨酸的细粉，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤；精密量取续滤液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含0.2 mg盐酸赖氨酸的供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.04 mol/L磷酸二氢钠溶液（10%氢氧化钠溶液调节pH至7.2）-甲醇-乙腈（70∶15∶15，V/V/V）；流速：1.5 ml/min；柱温：35 Ⅰ；检测波长：338 nm。将供试品按照自动衍生化进样程序，与硼酸盐缓冲溶液（取硼酸钠15.25 g，加水100 ml溶解，并用45%氢氧化钠溶液调节pH至10.2）混合后，再与OPA混合并定时反应2 min后，注入HPLC仪中。自动衍生化进样程序见表1。在此色谱条件下，空白溶剂中未见未反应的衍生试剂OPA的色谱峰，供试品溶液中未见干扰赖氨酸衍生物色谱峰的杂质峰，赖氨酸理论板数＞3 000。色谱见图1。

表1 自动衍生化进样程序Tab 1 Automatic derivatization and injection procedure

2.3 线性关系考察

图1 柱前衍生化高效液相色谱图A.空白溶剂；B.对照品；C.供试品Fig 1 Pre-column derivatization HPLC chromatogramsA.blank solution；B.reference；C.test sample

精密称取盐酸赖氨酸对照品20 mg，置于25 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，以此溶液作为线性试验母液。分别精密吸取上述线性试验母液适量，加水制成质量浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/ml的系列对照品溶液。取上述系列对照品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件进样测定。以质量浓度（x，mg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得盐酸赖氨酸的回归方程为y＝2.021 9×103x－26.34（r＝0.999 5）。结果表明，盐酸赖氨酸质量浓度在0.027 4～0.438 8 mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密量取盐酸赖氨酸对照品溶液0.5 μl，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次。结果，峰面积RSD为0.55%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取“2.1”项下供试品溶液S1、S2、S3各1份，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.2”项下色谱条件进样。结果，峰面积RSD分别为0.67%、0.58%、0.79%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取五维赖氨酸颗粒、赖氨肌醇维B12口服溶液、赖氨酸磷酸氢钙片各6份，分别按“2.1”项下方法制成供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，按外标法计算盐酸赖氨酸的含量。结果，含量RSD分别为0.78%、0.66%、0.84%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取五维赖氨酸颗粒0.20 g，共9份，分别置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”项下对照品贮备液适量，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为五维赖氨酸颗粒加样回收率试验样品溶液。精密量取赖氨肌醇维B12口服溶液0.2 ml，共9份，分别置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”项下对照品贮备液适量，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为赖氨肌醇维B12口服溶液加样回收率试验样品溶液。取赖氨酸磷酸氢钙片10片，研细，精密称取约相当于10 mg盐酸赖氨酸的细粉，共9份，分别置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”项下对照品贮备液适量，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为赖氨酸磷酸氢钙片加样回收率试验样品溶度。按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算加样回收率，结果见表2。

表2 3种复方制剂的加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of 3 compound preparations（n＝9）

2.8 样品含量测定

取盐酸赖氨酸对照品溶液与供试品溶液S1、S2、S3，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。同时，按国家标准方法茚三酮比色法测定五维赖氨酸颗粒及赖氨酸磷酸氢钙片中盐酸赖氨酸的含量，按国家标准方法甲醛滴定法测定赖氨肌醇维B12口服溶液中盐酸赖氨酸的含量。将HPLC法测定结果与国家标准方法测定的结果进行比较，结果见表2。由表2可知，HPLC法与国家标准方法测定的结果一致，精密度有所提高。

表3 3种复方制剂的盐酸赖氨酸含量测定结果比较（%）Tab 3 Comparison of lysine hydrochloride content of 3 compound formulations（%）

3 讨论

3.1 衍生化方法的选择

柱前衍生化HPLC法具有分析时间短、方法灵活多样、灵敏度高的优点，一直是分析化学领域探索的重要课题。OPA法为一种常用的衍生化方法，其缺点是OPA只能与一级氨反应，不能同时检测二级氨，使OPA-氨基酸的稳定性差、需要及时进样；考虑到复方盐酸赖氨酸制剂所含的氨基酸为一级氨，且其他主药成分和辅料对衍生化的干扰较小，故选用反应迅速、对仪器设备要求较低的、易于实现自动化的OPA法。OPA与硫醇试剂联用，能与赖氨酸迅速反应，产生具有高荧光强度的异吲哚衍生物，这些衍生物可以被荧光检测器或紫外检测器检出[8]。考虑到本次样品的质量浓度在20µg/ml以上，故采用紫外检测器。

3.2 色谱条件的优化

唐涛[9]曾以OPA及2，4-二硝基氟苯为衍生剂，考察了柱温、衍生剂用量、反应时间及流动相pH等因素对HPLC分析结果的影响。本文参考其色谱条件，确定了新的色谱条件：柱温为35 Ⅰ，流动相pH为7.2，衍生剂比例为OPA-赖氨酸（50∶1，V/V）。由于OPA与赖氨酸的衍生物不稳定，其峰面积会随时间的延长而减小，故采用自动程序进行衍生化，供试品与衍生剂精确混匀，准确反应2 min后立即进样分析。

利用二极管阵列检测器对衍生产物进行光谱扫描，提取衍生物紫外吸收图谱，可见在231 nm和338 nm波长处有最大吸收。考虑到衍生剂在230 nm波长处有紫外末端吸收，会在色谱中形成杂峰，故选择338 nm作为检测波长。

3.3 不同测定方法对含量测定结果的影响

赖氨肌醇维B12口服溶液的质量标准中采用甲醛直接滴定盐酸赖氨酸，通过pH的变化来指示终点；五维赖氨酸颗粒（片）、赖氨酸磷酸氢钙片质量标准中采用茚三酮比色法定量测定盐酸赖氨酸的含量。这两种方法各有优缺点。甲醛滴定法操作简单、成本低，当样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量；但该反应的终点依靠pH来显示，根据碱的消耗量来计算赖氨酸浓度，误差较大，且测试的误差随样品浓度的降低逐渐增大，仅适合测定高浓度样品[10]。茚三酮比色法是利用茚三酮与氨基酸反应生成有色物质，该物质在565 nm波长附近有最大吸收，且吸收强度与氨基酸含量呈正比；但该方法受溶液pH、显色剂用量、加热时间和冷却时间多重影响，精密度、重复性、专属性均较差[11-12]。柱前衍生化HPLC法专属性强、灵敏度高、重复性和准确性均较好，将其所测得的盐酸赖氨酸的含量结果与原质量标准方法进行比较，基本一致，而精密度有所提高。因此，该方法可用于含有盐酸赖氨酸的复方制剂的质量控制。

[1]左云龙，王兴勇.口服L-赖氨酸对小儿生长发育及营养影响的临床研究[J].现代医药卫生，2004，20（19）：1 960.

[2]国家药典委员会编.WS-10001-（HD-0482）国家药品标准：化学药品地方标准上升国家标准：第5册[S].2002：267.

[3]国家药典委员会编.WS-10001-（HD-0304）国家药品标准：化学药品地方标准上升国家标准：第4册[S].2002：23.

[4]国家药典委员会编.WS-10001-（HD-0597）国家药品标准：化学药品地方标准上升国家标准：第7册[S].2002：23.

[5]国家药典委员会编.WS-10001-（HD-0596）国家药品标准：化学药品地方标准上升国家标准：第7册[S].2002：20.

[6]国家药典委员会编.WS-10001-（HD-0387）国家药品标准：化学药品地方标准上升国家标准：第4册[S].2002：309.

[7]国家药典委员会编.WS-10001-（HD-0388）国家药品标准：化学药品地方标准上升国家标准：第4册[S].2002：313.

[8]陆明，孙黛妮，汪杨，等.OPA-FMOC联用柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量[J].药物分析杂志，2010，30（12）：2 323.

[9]唐涛.氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用[D].南京：南京理工大学，2006：6.

[10]李春兰，庞克坚，纪平山.甲醛酸碱法测定赖氨酸王浆口服液的含量[J].海峡药学，1995，7（1）：85.

[11]刘飞飞，李群，于岚.茚三酮比色法定量检测盐酸赖氨酸条件的研究[J].中国食品添加剂，2010，5（102）：223.

[12]崔敏，傅婕，迟原龙，等.茚三酮比色法和甲醛滴定法测定水解胶原的比较[J].中国皮革，2011，7（40）：1.