植物乳杆菌B－17产细菌素发酵条件的研究

曹珂珂，李 妍，张立丰

蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠，233030

细菌素是某些细菌核糖体合成的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽［1－3］。乳酸菌产生的细菌素可以杀死或抑制一些食品腐败菌和病原菌，且在人体内易被蛋白酶分解，无毒副作用，热稳定性好，无残留，因此乳酸菌细菌素是一种备受青睐的天然的食品防腐剂［4－5］。在前期研究中，笔者从泡菜老液中分离到植物乳杆菌B－17［6］。该菌是一株具有产广谱细菌素能力的菌株，它所产细菌素不仅可以抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，还可以抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌；并且该菌所产细菌素具有良好的耐酸、耐热性能，在食品加工中具有良好的应用前景。

乳酸菌所产细菌素的能力除了与菌种自身特性有关外，还与发酵培养基和发酵条件有关［7］，如碳源、氮源、培养温度、pH值等。本研究采用MRS肉汤培养基作为基础培养基，研究培养基和培养条件对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响，旨在获得最佳工艺条件，为植物乳杆菌素的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）菌 种：植 物 乳 杆 菌 （Lactobacillus plantarum）B－17，分离自泡菜老液；指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli），由蚌埠学院生物与食品工程系微生物实验室提供。

（2）主要培养基：MRS培养基，M17培养基，LB培养基。

（3）主要仪器：BSD－YX2200立式智能精密摇床（上海恒讯实业有限公司医疗设备厂），BHC－1300ⅡA／B2生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司），YM50压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司），JW－3021高速离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司），752型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 方法

（1）发酵液的制备：将植物乳杆菌种子液按3%接种量接入到MRS培养基中，37℃培养24h，4℃、8 000r／min离心10min，取上清，经细菌过滤器过滤，收集发酵上清液。

（2）抑菌性的测定：单层平板打孔法做无菌发酵上清液的抑菌试验。取100μL指示菌菌悬液（约107cfu／mL）涂布LB平板，然后用直径6mm打孔器在上述平板上均匀打出4个孔，取0.1mL上清液注入小孔中，室温下扩散4h后，37℃培养12h，检测抑菌圈的大小［8］。

（3）菌体生长的测定：用分光光度计测600nm下的吸光度OD600值［9］。

2 结果与分析

2.1 温度对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

发酵温度影响植物乳杆菌的生长及其细菌素的合成。将植物乳杆菌B－17分别在25、30、37、42℃条件下培养24h，测菌体所产细菌素的抑菌圈直径，结果如图1所示。培养温度在30℃至37℃时抑菌圈相对较大，其中30℃时抑制圈直径最大，此时抑菌活性最强，说明B－17菌株产细菌素的最适温度为30℃。当培养温度高于37℃时，抑菌圈直径和菌体生物量迅速下降。

图1 温度对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

2.2 起始pH对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

将MRS培养基起始pH值分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，30℃培养24h后，分别测定不同起始pH对产细菌素的影响。结果表明，起始pH为6.0～7.0时，B－17菌株产生的细菌素抑菌活性较高，pH高于或低于此范围时，抑菌性明显降低，当pH为6.5时，抑菌性最高（图2）。

图2 起始pH值对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

2.3 培养时间对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

将植物乳杆菌B－17在30℃培养48h，每隔4 h取出一支发酵液，测菌液的OD600值和抑菌圈直径，绘制生长曲线。结果表明，B－17菌株在 MRS培养基中生长良好，12h后进入稳定期。植物乳杆菌B－17在培养4h后开始产生细菌素，培养16h后所产细菌素的抑菌圈直径最大，细菌素效价达到最高值，在稳定期内细菌素的抑菌圈直径相对较稳定，32h后开始逐渐下降。

发酵时间较短，植物乳杆菌B－17菌株细胞生物量和细菌素的产量都较低；若发酵时间较长，细菌素效价下降，原因可能是发酵时间过长，培养基中的营养物质消耗过多，菌体则利用自身的代谢产物作为营养物质；也可能是植物乳杆菌B－17菌体吸附了一部分细菌素，造成发酵液中的细菌素浓度降低；还有可能是菌株在发酵后期自身产生的蛋白酶对细菌素有降解作用，从而使发酵液的细菌素效价下降［10］。

图3 培养时间对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

2.4 碳源葡萄糖对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

配制MRS培养基，葡萄糖浓度分别为10、20、30、40和50g／L，在上述最佳培养条件下培养，观察葡萄糖浓度对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响。结果如图4所示，当葡萄糖浓度在30g／L时，该细菌素所产抑菌圈的直径最大。

图4 葡萄糖含量对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

2.5 氮源对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

在基础培养基中加入20g／L的牛肉浸膏、酵母浸膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨和蛋白胨，在上述最佳培养条件下培养，观察不同的氮源对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响。结果如图5所示，当植物乳杆菌在添加20g／L的酵母浸膏后，细菌素的抑菌圈直径最大。植物乳杆菌合成细菌素时需要有机氮源的参与，营养丰富的某些氮源可能诱导了细菌素基因的启动［11］。

图5 氮源对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

2.6 吐温－80对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

配制不同浓度吐温－80的MRS培养基，添加量分别为0、1‰、3‰、5‰、7‰、9‰，在上述最佳培养条件下培养，观察不同浓度的吐温－80对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响。结果如图6所示，当吐温－80添加量为3‰时，抑菌圈直径最大。吐温－80是表面活性剂，能改善微生物细胞膜的通透性，从而促进营养物质的吸收，促进细菌素的产生，同时提高细菌素的活性［12］。

图6 吐温－80含量对植物乳杆菌B－17产细菌素的影响

2.7 正交试验

选择培养温度、初始pH值和碳源葡萄糖浓度，进行三因素三水平L9（34）正交试验，结果如表1所示。由表1可以看出，三因素对植物乳杆菌B－17所产细菌素的影响顺序为A＞B＞C，即培养温度＞初始pH值＞葡萄糖含量，三水平最佳选择为A2B2C1。

表1 正交试验结果

正交试验验证试验：由于正交试验优化结果在正交试验中没有出现，补做验证试验。按最佳水平A2B2C1，即发酵液初始pH为6.5，30℃培养16h，葡萄糖含量为20g／L时，发酵植物乳杆菌B－17，发酵结束后，4℃、8 000r／min离心10min，取0.1 mL上清，用打孔法测得抑菌圈直径为2.193cm，优于正交试验中最佳值第5组的结果。

3 结 论

通过单因素和正交试验对植物乳杆菌B－17产细菌素的培养条件进行优化，结果表明，30℃培养时，初始pH为6.5时，植物乳杆菌B－17所产细菌素的抑菌圈最大；在该条件下培养16h，细菌素的抑菌圈直径最大。最佳碳源为葡萄糖浓度为30 g／L，最佳氮源为20g／L的酵母浸膏，3‰的吐温－80对细菌素的刺激作用最强。正交试验结果表明，发酵液初始pH为6.5，30℃培养，葡萄糖含量为20 g／L时，植物乳杆菌B－17所产细菌素的抑菌圈最大，为2.193cm，较优化前提高了20%左右。

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