施马伦贝格病毒RT-LAMP检测方法的建立

袁向芬，吴绍强，张永宁，林祥梅

（中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 100029）

2011年秋季，德国北部和荷兰西部等地一些奶牛场暴发了一种以发热、产奶量下降、腹泻、严重时流产等为临床症状的新型动物疫病。德国弗里德里希洛福勒研究所（Friedrich-Loeffler-Institut，FLI）通过实验室诊断与研究，确定导致此次疫病的病原体为一种新型布尼亚病毒，并将其命名为施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus，SBV），将其引起的疫病称为施马伦贝格病[1]。该病主要感染绵羊、牛、山羊以及鹿等反刍动物，截至2013年10月，其已迅速蔓延至28个国家，引起了世界动物卫生组织（OIE）、欧盟和国际社会的高度重视。

鉴于SBV可通过精液等遗传物质传播，加之我国与欧盟国家之间的反刍动物遗传物质贸易频繁，建立一种敏感、快速、特异及临床诊断可行的检测方法尤为迫切，目前，可用于施马伦贝格病诊断的技术主要包括：病毒分离[2，3]、中和试验[4]、免疫荧光[5]、ELISA[5]及Real-Time RT-PCR[6]等方法。然而，以上几种检测方法或需借助特殊仪器，或需较长周期，对试验环境的要求也较为严谨，因此并不完全适用于养殖场、野外及口岸的现场检疫。环介导等温扩增技术（loop-medieated isothermal amplif i cation，LAMP）自2000年首次报道以来，因其高效、快速、高特异性等优点被广泛应用于动物疫病的检测工作[7-10]。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在简单的等温条件下即可实现靶序列的高效扩增[11，12]，整个过程中对环境、仪器等条件的要求均极其简单，特别适用于动物疫病的现场检疫。本研究针对SBV的S基因节段建立了其RTLAMP方法，并通过一系列试验证明该方法与实时荧光RT-PCR方法相比具有良好的敏感性和特异性，同时对于临床样品的快速检测也具有高度适用性。

1 材料和方法

1.1 样品

SBV阳性RNA样品由德国FLI实验室提供，用于提取RNA的病毒培养液浓度为6×107TCID50/mL。由于与SBV同属、且亲缘关系很近[13]的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）、沙门达病毒（Shamonda virus，SHAV）、艾罗病毒（Aino virus，AINOV）、道格拉斯病毒（Douglas virus，DOUV）Australia 株、道格拉斯病毒（Douglas virus）Texas株和辛波病毒（Simbu virus）多为国外动物疫病，因此特异性试验所需的相关病毒S基因节段核酸均由宝生物工程（大连）有限公司全基因合成获得，合成序列参考表1。

103份牛、羊临床全血样品采集自内蒙、天津等地养殖场。

1.2 引物的设计与合成

本研究对比了GenBank中SBV及其同属各病毒的基因序列，针对SBV的S基因节段序列，利用Primer Explorer version 4在线引物设计软件进行引物设计，设计了一套用于LAMP反应的引物（表2），引物交宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 病毒参考序列

表2 引物设计

1.3 RNA提取

阳性RNA样品由德国FLI实验室提供，其提取按照Trizol法进行，取1mLSBV病毒培养 液（6×107TCID50/mL） 进 行RNA的 提 取，用30μLDEPC水进行RNA的溶解，经换算可知RNA浓度相当于2×106TCID50/μL。临床血液样品RNA的提取，有本实验室按照Trizol法提取，具体操作参照说明书进行。提取的RNA均置于-80℃冰箱内保存备用。

1.4 RT-LAMP条件优化与方法建立

为实时监测不同反应条件下RT-LAMP的进展情况，反应条件的优化借助环介导等温扩增实时浊度仪LA-320c进行，在Loopamp RNA Amplification Kit（RT-LAMP）试剂盒（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）基础上，主要对反应的引物浓度、退火温度（60-65℃）、反应时间进行优化（表3）。

1.5 RT-LAMP方法敏感性及特异性分析

用优化后的RT-LAMP检测方法对SBV同属的 AKAV、SHAV、AINOV、DOUV Australia株、DOUV Texas株及Simbu病毒的S节段核酸样品进行扩增，评估本方法的特异性。设置SBV RNA样品为阳性对照，灭菌水为阴性对照。另外，按照优化后的条件和程序对本方法灵敏度进行评估，采用10倍系列稀释的SBV RNA样品（2×106～2×10-1TCID50/μL）进行，来确定本方法的最低检测限。反应结果可通过肉眼观察判定：当反应液中加入荧光染料钙黄绿素（Calcein）时，可根据反应后溶液的颜色变化进行鉴定，阳性反应溶液会由原来的橙色变为亮绿色，阴性仍保持橙色；还可利用电泳分析进行判定：取5μL反应液于2.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外下观察电泳条带并拍照记录。

表3 温度和内引物浓度优化

1.6 SBV与SHAV的鉴别诊断

SBV和SHAV S基因节段序列同源性极高，可达97%，因此基于S节段的常规核酸扩增技术无法实现两者的准确鉴别。通过对GenBank中SBV和SHAV的S节段基因序列进行酶切位点分析发现，引物F1和F2对应序列之间的靶序列上，SHAV存在一特异性酶切位点Af l II（5'C^TTAAG3'）（表4），而SBV并不存在该位点，因此，可通过对RT-LAMP反应产物进行酶切来进一步鉴别SBV与SHAV。

表4 酶切位点序列分析

1.7 Real-time RT-PCR方法

德国FLI实验室针对SBV的S基因节段建立了检测施马伦贝格病的荧光定量RT-PCR方法[6]。该方法的商品化试剂盒已由Qiagen公司进行生产与销售（货号FLI B585）。参照该试剂盒说明书，对10倍系列稀释的SBV阳性RNA及制备的其同属6种病毒S节段核酸样品进行扩增，反应结束后，与RT-LAMP检测方法的灵敏度及特异性进行比较。其反应程序为：45℃ 10min（反转录）；95℃ 10min（预变性）；95℃ 15s，56℃ 30，72℃30s，42个循环（PCR反应），在56℃退火阶段进行荧光信号的收集，全程108min。

1.8 临床样品的检测

用建立的RT-LAMP方法检测103份临床样品，并与荧光定量RT-PCR的检测结果进行比较。

2 结果

2.1 RT-LAMP方法优化

经过一系列优化，确定了SBV RT-LAMP方法的反应体系（25μL）为：FIP和BIP各40pmol，F3和B3各5pmol，LF和LP各20pmol，2×Reaction Mix 12.5μL（Tris-HCl（pH 8.8）40 mM，KCl 20mM，MgSO416mM，（NH4）2SO420mM，Tween 200.2%，Betaine 1.6 M，dNTPs 2.8mM each），Enzyme Mix 1.0μL，核酸RNA 5μL，另外，反应液中还加入1μL荧光试剂FDR（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）来监测扩增产物。反应程序为：63℃恒温下扩增50min；80℃酶灭活5min，该程序既可在恒温水浴锅中进行，也可在金属浴及各种核酸扩增仪等仪器中进行。反应后，通过肉眼观察颜色变化即可判定反应阴阳性。

2.2 RT-LAMP方法的敏感性和特异性

用建立的RT-LAMP方法对10倍系列稀释的SBV阳性RNA样品进行扩增，结果如图所示（图1A，1B），本方法可成功检测到2×100TCID50/μL的阳性RNA，染料法与琼脂糖凝胶电泳法的结果一致，结合加入反应体系的RNA体积，灵敏度可达10TCID50。特异性试验显示（图1D），仅SBV及SHAV发生扩增，反应管颜色由原来的橙色转变为亮绿色，与电泳结果一致（图1E），说明该方法与SHAV存在交叉反应。荧光定量RTPCR方法的灵敏度同为10TCID50（图1C），特异性试验显示其可与SHAV、DOUV Australia株和DOUV Texas株发生交叉反应（图1F）。相比之下，本研究建立的RT-LAMP方法兼具了良好的敏感性和特异性。

图1 灵敏度与特异性试验

2.3 SBV与SHAV的鉴别诊断

图2 酶切鉴定试验

25μL酶切反应体系中包含5μL RT-LAMP产物，2.5μL cutsmart buffer，8U Af l II酶（New England Biolabs，USA）。37℃孵育过夜后，取10μL酶切产物于2.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外显像仪中观察酶切后条带的变化。结果与预期结果相符，SBV与SHAV呈现出不同的酶切结果，如图2所示，SBV LAMP产物经酶切后，与SBV LAMP产物的电泳条带一致，未发生变化，说明未发生酶切反应；而SHAV则在227bp位置有一明显新增条带产生，借此即可实现SBV与SHAV的鉴别性诊断。

2.4 临床样品检测

为评估本研究建立的RT-LAMP方法的临床适用性，本课题组采集了内蒙、天津等地的103份牛、羊全血样品，分别用本研究建立的RTLAMP方法及荧光定量RT-PCR方法对样品进行检测。结果显示，两种方法检测的阳性率均为0%。说明所采集的103份样品均为SBV阴性。

3 讨论

本研究建立了一种快速检测SBV的RT-LAMP方法，并利用酶切可鉴别诊断SBV及SHAV。环引物的应用大大加速了反应速率[14]，可在50分钟内完成扩增。同时，本方法具有高度的敏感性，可达10TCID50，与荧光定量RTPCR方法的敏感性相同。而特异性试验显示，本研究建立的RT-LAMP方法与德国FLI实验室所建立的qRT-PCR检测方法[6]相同。本法可与SHAV发生交叉反应，因为SBV和的SHAV两者S节段核酸序列同源性高达97%[15]。基于S节段的常规核酸检测方法极不易对两者进行区分，本类方法更适用于田间、养殖场及口岸等大量样品的初检。另外，本研究建立了基于Af l II酶切位点的酶切鉴定方法，可实现两者的鉴别诊断，增加本方法的特异性，为实验室确诊提供了可信的鉴别诊断方法。本方法的另外一个优点还在于，相比于荧光RT-PCR要借助昂贵精密的仪器而言，RT-LAMP可利用简单的恒温装置进行扩增，并可通过多种方法进行结果的判定，如通过肉眼判定、染料法以及传统的电泳法。研究显示，本方法采用的染料法完全可以满足常规检测的需要[16]，特别适用于大规模、野外或口岸的临床样品检测。相比之下，RT-LAMP方法兼具了良好的敏感性、特异性、快捷性及便利性，更适于口岸、养殖场等的现场检疫，为SBV的防控提供技术储备。

采集内蒙古、天津等地的牛、羊全血样品103份，统一处理后进行RT-LAMP检测。其结果与荧光定量RT-PCR方法的结果完全符合，样品检测结果均为SBV阴性，与中国境内目前无SBV存在的相关报道相符[17，18]。但考虑到SBV传播速度快、涉及范围广，该结果同时提示我国继续加强对SBV的口岸防控，同时制定相关防控政策，防止SBV跨境传入中国。

然而，LAMP技术也存在不足之处，这些不足也是限制LAMP技术发展的主要障碍。LAMP方法具有高效的反应速率，单个目的基因可于短时间内迅速扩增至109拷贝数，此时极易产生气溶胶，导致环境污染以及假阳性的出现，为控制该污染，实验人员在操作过程中应严格注意空间、仪器耗材等的分隔使用，同时反应后尽量利用染料法、比浊法等闭管方法进行判定[8，19-20]，防止反应产物的扩散。另外，有研究者通过试验发现LAMP反应对培养基及生物物质干扰具有较强抗性，因此对病毒核酸的提取质量要求较低[21]；且目前对于核酸提取技术的研究也有了很大的进展[22-25]，国内外已有公司 推出了一管式核酸提取试剂，在核酸提取时间及操作上提供了很大便利，然而探索一种可与LAMP技术配套的经济、快速、便捷、成熟的核酸提取技术，仍是LAMP技术发展及应用的迫切需要。

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