生鲜牛奶中不同类型金黄色葡萄球菌污染差异性分析

王 娟，黄秀梅，崔晓娜，盖文燕，曲志娜，王玉东，赵思俊，王君玮

（1.中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全监测室，山东 青岛 266032；2.山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），简称金葡菌，是造成人类食物中毒的常见致病菌之一，在自然界分布广泛，因此食品受其污染的机会较多。肠毒素是金葡菌引起食物中毒的主要致病因子，结构稳定，不易被破坏。据资料显示，金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）有多种类型，不同类型肠毒素的毒力强弱不同，其中A型肠毒素（SEA）毒力最强[1]，引起的食物中毒事件最多。由于金葡菌是引起奶牛乳房炎的主要原因，极易造成生鲜牛奶中金葡菌污染，金葡菌在鲜牛奶中生长繁殖过程中产生的肠毒素不容易通过加热等方式分解。本文旨在了解目前我国生鲜牛奶中产肠毒素金葡菌污染状况，分析产不同类型肠毒素金葡菌在不同区域的流行状况，为有效控制我国牛奶中金葡菌肠毒素提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株。金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、表皮葡萄球菌（ATCC12228），购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 主要试剂和培养基。7.5%NaCl肉汤、Baird-Parker琼脂、MH肉汤、生化反应管，均为北京陆桥技术有限公司生产；科玛嘉显色培养基，郑州科玛嘉生物有限公司生产；冻干兔血浆，广东环凯生物技术有限公司生产；Master Mix，美国Promega公司生产；琼脂糖，西班牙Biowest生产；Marker 2000，宝生物工程（大连）有限公司生产。

1.1.3 主要仪器设备。可见分光光度计、基因扩增仪（BIO-RAD）、凝胶成像系统（BIO-RAD）等。

1.1.4 样品。在山东、湖南、内蒙等三省区的挤奶站和奶牛场共采集鲜奶样品360份，冷藏，24h内运送至实验室。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离。取1mL牛奶样品接种到10mL7.5%NaCl肉汤中，37℃温箱培养20h后，将增菌后的液体接种于Baird-Parker平板，37℃培养48h，然后挑取可疑菌落接种到科玛嘉金葡菌显色培养基上。

挑取可疑菌落，划线接种到营养琼脂平板纯化培养后，待进一步细菌鉴定。

1.2.2 生化鉴定。挑取纯化好的单个菌落进行触酶试验和血浆凝固酶试验。触酶试验阳性的菌落再进行血浆凝固酶实验；血浆凝固酶实验中，呈现凝集者该菌判为金黄色葡萄球菌。

1.2.3 金黄色葡萄球菌PCR鉴定。用DNASTAR软件，针对金黄色葡萄球菌设计1对引物，上游引 物 P1：5'- GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'，下 游 引 物 P2：5'- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC -3'。扩增片段长度约为279pb。煮沸法[2]提取DNA，反应体系（25μL）如下：上下游引 物（25pmol/μL） 各 0.5μL，DNA 模 板 1μL，Mix 12.5μL ，加ddH2O补至25μL。PCR循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性1min，57℃退火50s，72℃延伸50s，扩增36个循环；最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物5μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5%μg/mL），电泳结束后，在紫外灯下观察并用电泳图像分析系统拍照，记录试验结果。

1.2.4 金黄色葡萄球菌肠毒素基因扩增。参照Johnson等[3]报道合成SEA、SEB、SEC、SED、SEE基因的PCR引物，根据Jarraud S等[4]报道合成SHE、SEI、SEG，根据Monday等[5]报道合成SEJ基因的PCR引物（表1）。

表1 金葡菌肠毒素引物序列

反应体系为：上、下游混合引物（10μM）各2.0 μL，DNA 模板 1.0μL，Mix 12.5μL，加 ddH2O补至25μL。反应程序为：先94℃预变性5min；再94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃终延伸10min；反应完成后4℃保存。

1.2.5 金葡菌及其肠毒素污染差异性统计分析应用SAS软件对实验数据进行统计分析。

2 结果

2.1 金葡菌分离鉴定结果

2.1.1 生化鉴定结果。分离菌株生化结果：触酶试验阳性，葡萄糖、麦芽糖、甘露醇阳性，明胶阳性，山梨醇阴性，血浆凝固酶阳性。

2.1.2 PCR鉴定结果。以标准菌株ATCC29213为阳性对照，从牛奶样品中分离菌株能扩增出大小约为279pb基因片段（图1），阳性对照样品均能扩增出与预期大小的DNA基因片段。对分离菌株PCR产物测序结果表明，该基因片段长度为279bp。序列结果与GenBank公布的序列同源性达99.5%以上，说明扩增的基因片段为金黄色葡萄球菌16S-23SrRNA基因的保守区序列。鉴定结果与生化鉴定结果一致。

图1 金黄色葡萄球菌PCR扩增结果

从采集的360份生牛奶中，检出金黄色葡萄球菌102株，检出阳性率为28.33%；其中从山东分离36株，湖南分离36株，内蒙分离30株。

2.2 金葡菌肠毒素检测结果

检测结果显示，102株金葡菌中，有96株产SEA、SEB、SEC等9种不同肠毒素基因，占94.12%，同时含2种及以上毒素的菌株有71株，占69.61%。产SEI的菌株最多，有86株，占84.31%。产其它肠毒素的有：产SEA的有20株，占19.61%；产SEB的有9株，占8.82%；产SEC的有5株，占4.90%；产SED的有 8株，占7.84%；产SEE的有2株，占1.96%；产SEG的有50株，占49.02%；产SHE的有39株，占38.24%；产SEJ的有7株，占6.86%。（图3）。

图2 各型肠毒素阳性菌扩增结果

图3 产不同肠毒素的菌株比例

2.3 不同区域分产毒素金葡菌株分布状况

通过比较发现，湖南和内蒙所有分离菌株均产SEA—SAJ中的不同毒素，而从山东省分离菌株中产SEA—SAJ中不同肠毒素的菌株占的分离菌株数的55.56%；其中湖南和内蒙分离所有菌株均产SEI，而约有55.56%的山东分离菌株产该毒素；山东和内蒙约有55%的分离菌株产SEG，而约有35%的湖南分离菌株产该毒素；山东和湖南分离菌株中产SEA的菌株均高于20%，而内蒙只有不足10%的分离菌株产该毒素；山东分离株有50%的产SHE，而湖南和内蒙约有30%左右的分离菌株产该毒素，具体见图4。

3 讨论

由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒已经成为世界性公共卫生问题之一[6]。本次实验从360份生鲜牛奶中，检出金黄色葡萄球菌102株，阳性率为28.33%；分离菌株中产各型肠毒素的达94.12%，同时能产两种以上肠毒素的有63株，占分离菌株数的61.76%。结果说明，生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌污染较严重，同时，产各型肠毒素的菌株普遍存在，对牛奶及奶制品质量安全造成风险较大。

图4 三省产不同金黄色葡萄球菌肠毒素菌株分布

所有分离菌株中能产毒性最强肠毒素SEA的菌株占近20.0%，这与Hazariwala等[6]报道的18.86%基本一致，远低于张严峻等[7]报道的食品中分离菌株产该型肠毒素占51.7%，这可能与检测产品的单一性有关。湖南和内蒙的所有分离菌都产不同型别的金黄色葡萄球菌肠毒素，山东分离菌株中55.56%的金葡菌产不同型别肠毒素；三个地区分离菌产肠毒素类型也各不相同，各地区生鲜牛奶中产肠毒素的金黄色葡萄球菌存在明显差异，其原因有待于进一步研究。

检测结果说明，我国生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染率处于较高水平，这与国内相关报道相符[8-9]，主要是由于奶牛乳房炎和挤奶过程中的交叉污染造成的。因此，要防止金黄色葡萄球菌的污染，奶牛场应定期对奶牛进行乳房炎检测，并将挤出的鲜奶及时冷藏保存、运输，降低细菌繁殖速度，减少毒素的产生，从源头上降低金葡菌肠毒素对牛奶及其制品带来的安全风险。

本研究表明，从生鲜牛奶中分离的产各型肠毒素的金黄色葡萄球菌阳性率较高，且不同地区间产肠毒素类型有所差异。金黄色葡萄球菌引起人和动物的食物中毒事件在世界各国每年都有发生。实验证明，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒是由其产生的肠毒素因子、而非活菌所致。食物中若含有足够量的肠毒素即可引起食物中毒，症状为恶心、呕吐、腹部疼痛和腹泻[10]。由此可见，对产不同类型肠毒素金黄色葡萄球菌进行研究，掌握不同地区菌株的分布状况，对提高牛奶及其制品质量，为食源性疾病的预防与控制提供可靠的信息和技术支持。

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[5]Monday S R，Bohach G A.Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin genes in staphylococcal isolates[J]. Clin Microbiol，1999，37（10）：3411-3414.

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