基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰作用机制研究❋

王秀凤，张 磊，伍庆华，闵建新，马 娜，罗来成△

(1.广东药学院基础学院，广州 510006;2.江西中医药大学基础医学院，南昌 330006)

基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰作用机制研究❋

王秀凤1，张 磊1，伍庆华2，闵建新2，马 娜1，罗来成1△

(1.广东药学院基础学院，广州 510006;2.江西中医药大学基础医学院，南昌 330006)

目的:探讨定经汤调节卵巢早衰的作用机制。方法:SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、定经汤干预组，分别检测其与卵巢早衰相关的生物分子，如β－EP、IL－1、NOS、NO、GnRH、CRH、FSH、LH、E2、P、ACTH和CORT;建立基于支持向量回归机的生物分子网络模型，探究定经汤干预下各生物分子之间相互调控关系。结果:卵巢早衰大鼠灌服定经汤后，垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子指标值上升，垂体－卵巢轴及肾上腺轴的变化反馈到下丘脑，使得IL－1、NOS和NO指标值上升;通过IL－1的枢纽作用，使得β－EP、GnRH和CRH上升;最后下丘脑生物分子的上升又使得垂体－卵巢轴及肾上腺轴的靶腺层生物分子进一步上升，垂体－卵巢轴垂体层生物分子稍有下降。结论:定经汤干预下卵巢早衰相关生物分子网络趋于平衡，定经汤调节卵巢早衰过程中起到关键作用的生物分子为IL－1。

定经汤;卵巢早衰;作用机制;支持向量回归机

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是一种多病因所致的卵巢内卵泡耗竭或被破坏而发生的卵巢功能衰竭［1］，是指女性在40岁以前出现以闭经、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高为特征的一种疾病。西医治疗卵巢早衰一般采用雌激素［2］，但长期使用有可能引发妇科肿瘤。对于肾虚肝郁型卵巢早衰，中医十分强调补肾疏肝。明末清初著名医家傅山所著《傅青主女科》中的定经汤由当归、白芍、菟丝子、熟地、山药、白茯苓、柴胡和荆芥穗组成，治疗肾虚肝郁型卵巢早衰效果明显［3］。

众多研究［4－9］提示，与卵巢早衰相关的生物分子主要包括下丘脑生物分子6个，即β－内啡肽 (β－Endorphin，β－EP)、白介素－1(interleukin－1，IL－1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、一氧化氮(nitric oxide synthase，NO)、促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)和促肾上腺皮质激素释放激素 (corticotropin releasing hormone，CRH);垂体－卵巢轴生物分子4个，即促卵泡激素(follicle－stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)和孕酮(progesterone，P);垂体－肾上腺轴生物分子2个，即促肾上腺皮质激素(adrenocor ticotropic hormore，ACTH)和皮质醇(cortisol，CORT)。课题组前期利用因子分析方法得到定经汤调节卵巢早衰的3个主要调控因子［10］。本研究在此基础上利用支持向量回归机探讨各调控因子内部和调控因子之间的相互作用，进一步揭示定经汤调节卵巢早衰的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SD(Sprague Dawley)、SPF(Specific pathogen Free，SPF)级雌性大鼠90只，体质量200～220 g，由广东省实验动物中心提供(许可证号SCXK(粤)2008－0002)，基础饲料由广东省实验动物中心提供。大鼠购进后适应3 d观察动情期变化，选择连续有2个正常动情期的大鼠用于实验，采用随机数字表法分为正常组、模型组、定经汤干预组3组，每组30只。

1.2 主要试剂及仪器

0.9 %氯化钠注射液，藁城市四海药业有限公司;NOS药盒，南京建成生物工程研究所;CRH、GnRH、β－EP、IL－1、NO药盒，北京华英生物技术研究所;E2、P，美国SIGMA公司;7160全自动生化仪，日本日立;TDL80－2B离心机，上海安亭科学仪器厂;r－911全自动放免计数仪，中国科技大学实业总公司;声－光－电复合应激刺激装置(自制)。

1.3 动物造模及处理方法［11］

1.3.1 造模 用声－光－电复合刺激(先声－光刺激10 s，再声－光－电刺激60 s，最后电刺激5 s)，造模20 d，每日5次，5次间隔不定，1 h内完成。声、光、电3种刺激参数恒定:声音强度65 dB;光照强度500 lux，为闪烁状，频率1次/s，亮时500 lux，灭时300 lux;电压24～36 V。

1.3.2 给药方法 于造模同日给药，正常组和模型组灌蒸馏水，用药组灌定经汤药物溶液。定经汤由当归30 g、白芍30 g、菟丝子30 g、熟地15 g、山药15 g、白茯苓9 g、柴胡6 g和荆芥穗1.5 g组成，药物煎煮后，使得1 mL浓缩液约含生药量1 g。给药容积为1 mL，复方汤剂/100 g体质量，给药时间25 d(即为在应激刺激20 d后再继续给药5 d)，每日1次。

1.3.3 观察指标 全部动物在给药25 d后处死，股动脉取血，3000 r/min、20 min取上清液。取下丘脑，用新华滤纸吸干组织液和血液，加生理盐水1 ml(含0.05 mol/l醋酸20 ul)，研磨使组织充分粉碎。离心速度3000 r/min，离心10 min取上清。沉淀加生理盐水0.5 ml(含0.05 mol/l醋酸20 ul)。离心速度3000 r/min，离心10 min取上清。2次上清合并，用0.05 mol的NaOH25ul(调pH值7.4左右)。吸取上清液10 ul加入定量的蛋白试剂中，通过测定其吸光度测定蛋白含量。采用放射免疫分析法测定血清中的E2、P、LH、FSH、CORT、ACTH和NO，以及下丘脑匀浆液中的 CRF、IL－1、β－EP和GnRH。采用免疫组织化学法测定下丘脑匀浆液中的NOS。

1.4 支持向量回归机预测模型

1.4.1 支持向量回归机的基本模型［12］根据给定的样本集{(xi，yi)|i=1，2，…，k}，寻求一个反应样本数据的最优函数关系y=f(x)，其中xi为输入向量，yi为期望输出。采用适当的核函数K(xi， xj)，确定回归模型为:。上述回归模型中，α不为零或i不为零时对应的样本即为支持向量。常用的核函数有线性核、多项式核和RBF核等。

1.4.2 基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰生物分子网络模型 图1显示，课题组前期研究得到3个主要调控因子，分别为定经汤调节卵巢早衰的主调控因子、下丘脑自调控因子和垂体－肾上腺轴自调控因子［10］。其中起枢纽作用的关键生物分子为IL－1和CORT。根据前期研究构建定经汤调节卵巢早衰的生物分子网络。

图1 定经汤调节卵巢早衰生物分子网络

在此基础上，建立基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰生物分子网络模型如下:。在主调控因子内部将垂体－性腺轴和垂体－肾上腺轴生物分子FSH、LH、E2、P和CORT作为输入变量xi，i=1，2，3，4，5，下丘脑生物分子IL－1、NOS和NO分别作为输出变量f(x)，建立3个支持向量回归机模型，记为模型1～3。在下丘脑自调控因子中将IL－1作为输入变量x，β－EP、GnRH和CRH分别作为输出变量f(x)，建立3个支持向量回归机模型，记为模型4～6;反过来，将β－EP、GnRH和CRH作为输入变量xi，i=1，2，3，IL－1作为输出变量f(x)，建立1个支持向量回归机模型，记为模型7;在主调控因子内部将下丘脑生物分子IL－1、NOS和NO作为输入变量xi，i=1，2，3，垂体－性腺轴和垂体－肾上腺轴生物分子FSH、LH、E2、P和 CORT分别作为输出变量f(x)，建立5个支持向量回归机模型，记为模型8～12;在垂体－肾上腺轴自调控因子中将靶腺层生物分子CORT作为输入变量x，垂体层生物分子ACTH作为输出变量f(x)，建立1个支持向量回归机模型，记为模型13，反过来将ACTH作为输入变量x，CORT作为输出变量f(x)，建立1个支持向量回归机模型，记为模型14，总共建立14个支持向量回归机模型。核函数K(xi，xj)均选定为RBF核:K(xi，xj)=exp(－γ‖xi－xj‖2)，γ＞0。每个模型的参数γ和惩罚系数C需要优化确定。本文将数据集缩放到［0，1］，采用网格法搜索参数，使得留一法检验的MSE最小。

2 结果

2.1 定经汤调节卵巢早衰大鼠垂体－性腺轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子的含量变化

表1显示，模型组垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子含量相对正常组均有所下降，差异有统计学意义，说明造模成功;给大鼠灌服定经汤之后，垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子含量相比模型组均有所上升，且差异有统计学意义，说明定经汤能有效调节卵巢早衰。

表1 大鼠垂体-性腺轴及垂体-肾上腺轴靶腺层生物分子的含量变化(±s)

表1 大鼠垂体-性腺轴及垂体-肾上腺轴靶腺层生物分子的含量变化(±s)

注:与正常组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 FSH(mIU/ml) LH(mIU/ml) E2(pg/ml) P(ng/ml) CORT(ng/ml)正 常 组 11.73±0.90 34.69±2.04 20.84±5.10 1.96±0.55318.56±26.97模 型 组 9.85±1.64△ 31.42±1.22△△ 16.00±2.38△△ 1.46±0.41△△ 290.56±12.29△△定 经 汤 组 10.94±0.79△＊＊ 32.74±1.19△△＊＊ 20.14±2.11＊＊ 1.60±0.29△ 295.51± 7.39*

2.2 基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰生物分子网络模型测试

本研究利用 Scilab软件(vers 5.4.1，INRIA，Paris，France)自编程序，建立了14个基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰的生物分子网络模型。首先对14个支持向量回归机模型进行了留一法检验。对30个样本建立的支持向量回归机模型，留一法检验是先把第1个样本作为预测样本，其余29个样本作为训练样本，以此类推，每个模型总共得到30个预测误差及30个预测复相关系数。结果30个预测误差均小于10%，一定程度上说明模型的可行性。同时，基于支持向量回归机的卵巢早衰生物分子网络模型的30个复相关系数均大于0.95，亦说明模型预测效果较好，可靠程度较高。

2.3 基于支持向量回归机的定经汤调节卵巢早衰生物分子网络模型预测

表1显示，给卵巢早衰大鼠灌服定经汤之后，垂体－性腺轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子含量均有所上升，因此将全部30个样本作为训练样本，首先将垂体－性腺轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子FSH、LH、E2、P和CORT的指标值均乘以1.1(比原来增大10%)作为预测样本，分别应用模型1～3预测此时下丘脑生物分子IL－1、NOS和NO的变化;然后将下丘脑生物分子IL－1的指标值乘以1.1作为预测样本，分别应用模型4～6预测此时 β－EP、GnRH和CRH的变化;将β－EP、GnRH和CRH的指标值均乘以1.1作为预测样本，应用模型7预测此时IL－1的变化;将下丘脑生物分子IL－1、NOS和NO的指标值均乘以1.1作为预测样本，应用模型8～12预测此时垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子FSH、LH、E2、P和CORT的变化;将垂体－肾上腺轴垂体层生物分子ACTH的指标值乘以1.1作为预测样本，应用模型13预测CORT的变化，将垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子CORT的指标值乘以1.1作为预测样本，应用模型14预测ACTH的变化。定义生物分子的相对变化率:。分别求出预测生物分子指标值的平均相对变化率。按照大鼠灌服定经汤后垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子上升，垂体－卵巢轴及肾上腺轴生物分子的变化反馈到下丘脑，下丘脑进行自调节，下丘脑调节垂体－卵巢轴及肾上腺轴生物分子，垂体－肾上腺轴生物分子自调节的顺序(结果见表2～4)。

表2 主调控因子中垂体-卵巢轴及肾上腺轴生物分子×1.1时下丘脑生物分子变化率

表3 下丘脑自调控因子中IL-1×1.1时β-EP、GnRH和CRH的变化率

在下丘脑自调控因子中，根据模型7预测出，当β－EP、GnRH和 CRH均乘以 1.1时，IL－1增大20.36%，此时模型的复相关系数为0.9432。

表4 主调控因子中下丘脑生物分子×1.1时，垂体-性腺轴及肾上腺轴生物分子变化率

在垂体－肾上腺轴自调控因子中，根据模型13～14预测出，当靶腺层生物分子 CORT乘以1.1时，垂体层生物分子ACTH增大3.66%，模型的复相关系数为0.7995;而当垂体层生物分子ACTH乘以1.1时，靶腺层生物分子CORT仅增大0.27%，模型的复相关系数为0.8047。

表2显示，首先14个预测模型的复相关系数均大于0.78，说明14个预测模型均较可靠。在主调控因子中，当垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子上升时，除NO变化较小外，下丘脑生物分子IL－1和NOS均有较明显上升;表3显示，在下丘脑自调控因子中，当 IL－1上升时，β－EP、GnRH和CRH均有不同程度上升，另一方面当β－EP、GnRH和CRH上升时，IL－1大幅上升;表4显示，主调控因子中，当下丘脑生物分子上升时，垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子有不同程度上升，而垂体－卵巢轴垂体层生物分子有所下降且变化微小，可见此时垂体－卵巢轴靶腺层生物分子对垂体层生物分子的负反馈作用逐渐恢复。

3 讨论

结合表1～4，定经汤调节卵巢早衰首先使得主调控因子中垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴靶腺层生物分子指标值上升，然后垂体－卵巢轴及肾上腺轴的变化反馈到下丘脑，使得下丘脑部位生物分子IL－1、NOS和NO上升;接下来通过IL－1的枢纽作用，在下丘脑自调控因子中使β－EP、GnRH和CRH上升，同时β－EP、GnRH和CRH上升也会使IL－1上升;在主调控因子中下丘脑生物分子的上升又使得垂体－卵巢轴及垂体－肾上腺轴的靶腺层生物分子进一步上升，垂体－卵巢轴垂体层生物分子稍有下降;在垂体－肾上腺轴自调控因子中垂体层和靶腺层生物分子之间的相互调节趋于稳定，定经汤调节卵巢早衰相关生物分子网络趋于平衡。同时可以看出，在此过程中起到关键作用的生物分子为IL－1。

定经汤是调节卵巢早衰的经典方剂，本研究采用支持向量回归机建模对定经汤调节卵巢早衰大鼠生殖内分泌网络的非线性关系进行分析，加强了对定经汤调节卵巢早衰机制的认识。同时证实，支持向量回归机通过数据本身的内在联系建模，可以很好地拟合生殖内分泌网络中非线性关系，如果纳入更多生物分子可以对定经汤调节卵巢早衰的机制有更全面的认识。

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Mechanism Research of Ding Jing Decoction on Regulating the Premature Ovarian Failure Based on the Support Vector Regression

WANG Xiu－feng1，ZHANG Lei1，WU Qing－hua2，Min Jian－xin2，MA Na1，LUO Lai－cheng1△
(1．Basic School of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China; 2．Basic Medical School of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China)

Objective:Exploring the mechanisms of the premature ovarian failure(POF)regulation by Dingjing Decoction.Methods:90 SD rats were randomly divided into three groups:normal groups，model groups and Dingjing Decoction groups;Biomolecules which associated with premature ovarian failure:β－EP，IL－1，NOS，NO，GnRH，CRH，FSH，LH，E2，P，ACTH and CORT were detected.Regulation relations of biomolecules associated with POF regulation by Dingjing Decoction were explored based on support vector regression machine.Results:The values of biomolecules in pituitary－ovarian axis and target gland layer of pituitary－adrenal axis increased significantly in curing with Dingjing Decoction;then these changes feed back to the hypothalamus，leading the increase of the values of IL－1，NOS and NO in hypothalamus;then the values of β－EP、GnRH and CRH increased in hypothalamus through the pivotal function of IL－1; The values of biomolecules in target gland layer of pituitary－adrenal axis and pituitary－ovarian axis increased significantly，the values of biomolecules in the pituitary layer of hypothalamic－pituitary－ovarian axis decreased slightly，when the values of biomolecules in hypothalamus increased.Conclusions:The regulation relations of biomolecules network associated with to be balance.IL－1 play a pivotal role in the biomolecules network associated with POF regulation by Dingjing Decoction.

Dingjing Decoction;Premature ovarian failure;Mechanisms;Support vector regression machine

R289

:B

:1006－3250(2015)12－1516－03

2015－04－18

国家自然科学基金资助项目(81073073)－基于人工神经网络建模的补肾疏肝药对菟丝子－柴胡调整卵巢早衰作用机制研究;国家自然科学基金资助项目(81403153)－基于支持向量回归机的右归丸调节肾阳虚的作用机制研究

王秀凤(1980－)，女，山东泰安人，副教授，医学硕士，从事生物系统的数据挖掘研究。

△通讯作者:罗来成(1963－)，男，江西南昌人，教授，医学学士，从事生物信号处理研究，Tel:020－39352198，E－mail: llc1963@163.com。