白色念珠菌肠道感染对脾虚小鼠小肠组织中Perforin和Granzyme的影响❋

马贤德，韩晓伟，关洪全

(辽宁中医药大学，沈阳 110032)

白色念珠菌肠道感染对脾虚小鼠小肠组织中Perforin和Granzyme的影响❋

马贤德，韩晓伟，关洪全△

(辽宁中医药大学，沈阳 110032)

目的:通过对脾虚感染白色念珠菌小鼠小肠超微结构及黏膜组织中Perforin、Granzyme表达水平的观察，探讨机体在脾虚状态下感染白色念珠菌的部分免疫机制。方法:健康SPF级昆明种小白鼠60只，按随机数字表法分为空白对照组(N1组15只)、空白感染白念组(N2组15只)、脾虚模型对照组(M1组15只)、脾虚感染白念组(M2组15只)。分别令N2和M2组小鼠感染白色念珠菌，白念菌浓度为2×108CFU/ml，剂量为0.2 ml/10 g体质量，于染菌后第21天进行相关指标检测。采用RT－PCR法检测各组小鼠小肠组织中穿孔素(Perforin)、颗粒酶(Granzyme)mRNA表达水平;采用western－blot法检测各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme表达水平。结果:各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平检测结果显示，与N1组比较，N2组、M1组、M2组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高;与N2组比较，M1组Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著降低，而M2组Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高;与M1组比较，M2组Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高。结论:小肠局部黏膜组织中Perforin和Granzyme高表达水平可能是造成小肠黏膜局部损伤的免疫机制之一。

脾虚证;白色念珠菌;感染;穿孔素;颗粒酶

白假丝酵母菌(candida Albicans)又称白色念珠菌，是假丝酵母菌中最常见的致病菌。正常情况下，存在于人的口腔、上呼吸道、肠道及阴道中，数量极少，一般不引起疾病。当机体免疫功能下降或正常菌群失调时，白色念珠菌就会大量繁殖并改变生长形式侵入细胞引起疾病。脾虚证的发生不仅有先天因素，还与后天的饮食不节、嗜食肥甘等因素有密切关系。此外，消耗性疾病的中晚期常伴随着脾虚证的发生。

本研究拟通过观察脾虚模型小鼠感染白色念珠菌后，小肠黏膜组织中IL－10、12的表达水平，探讨白色念珠菌感染脾虚模型小鼠的部分机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级昆明种小白鼠60只，购自辽宁长生生物科技有限公司(实验动物生产许可证号SCXK(辽)2010－0001)。实验动物购入后，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物室内(许可证号SYXK(辽)2013－0009)。常规颗粒饲料喂养，自由食水，12 h昼夜节律。

1.1.2 实验药品 白色念珠菌菌株(Candida albicans 03382株)由北京大学第一医院皮肤科惠赠。猪油脂、甘蓝购自乐购超市长客总站店。Anti－Perforin(ab180773)、Anti－Granzyme B(ab53097)。

1.1.3 仪器设备 电热恒温培养箱(HH·B11 ·500型，上海跃进医疗器械厂);凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司，Tanon－4200SF型;梯度PCR仪，美国ABI公司，VERITI96孔梯度PCR型.

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 健康SPF级昆明种小白鼠60只，按随机数字表法分为空白对照组(N1组15只)、空白感染白念组(N2组15只)、脾虚模型对照组(M1组15只)和脾虚感染白念组(M2组15只)。

1.2.2 模型复制 实验第1天起，参照文献［1］将M1、M2组小鼠单日喂饲甘蓝，并强制性游泳至耐力极限;双日施加猪油0.2 ml/10 g/体质量灌胃，并正常进食，连续14 d，N1、N2组小鼠正常饲养。实验14 d后，按照脾虚模型宏观诊断标准［2］对模型复制组小鼠进行模型评价。

1.2.3 模型评价标准 造模小鼠出现体质量下降、便溏或稀便、食少纳呆、毛色枯槁、蜷缩聚堆、反应迟钝甚至胆怯状态等表现，说明脾虚造模成功。

1.2.4 白色念珠菌感染 脾虚模型复制成功后，对N2组和M2组小鼠经口感染白色念珠菌，白念菌浓度为2×108CFU/ml，剂量为0.2 ml/10 g体质量，N1、M1组小鼠给予等量生理盐水经口灌胃，感染后正常饲养21 d。

1.2.5 指标检测 各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA表达水平检测:采用RTPCR法检测各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA的表达水平。扩增引物序列:Granzyme:上游:5’－GACTTTGTGCTGACTGCTGCTCAC－3’;下游:5’－TTGTCCATAGGAGACGATGCCCGC－3’，扩增片段长度:465 bp。Perforin:上游:5’－TGCTAC ACTGCCACTCGGTCA－3’，下游:5’－GCATGC TCTGTGGAGCTGTTA－3’，扩增片段长度:566 bp。β－actin:5’－AGCGGGAAATCGTGCGTG－3’，5’－CAGGGTACAT GGTGGTGCC－3’，扩增片段长度: 288 bp。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像分析系统中采集电泳图片，并测定条带积分光密度值，以目的基因积分光密度值/内参基因积分光密度值比值作为统计数据进行统计分析。各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme蛋白表达水平检测:采用 western－blot法检测各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme的蛋白表达水平，凝胶成像分析系统采集图像，并测定条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值比值作为统计数据进行统计分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计分析。各组数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠小肠组织中Perforin mRNA及蛋白表达水平

表1、图1～2显示，与N1组比较，N2组、M1组、M2组小鼠小肠组织中Perforin mRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01);与N2组比较，M1组Perforin mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)，而M2组Perforin mRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01);与 M1组比较，M2组 Perforin mRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)。

表1 各组小鼠小肠组织中Perforin mRNA及蛋白表达水平(±s)

表1 各组小鼠小肠组织中Perforin mRNA及蛋白表达水平(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.01;与空白感染白念组比较:#P＜0.01;与脾虚模型对照组比较:△P＜0.01

组别 鼠数Perforin mRNA Perforin空 白 对 照 组10 0.136±0.010 0.133±0.013空白感染白念组 10 0.243±0.021* 0.227±0.016*脾虚模型对照组 10 0.220±0.014*# 0.200±0.020*#脾虚感染白念组 10 0.304±0.035*#△ 0.276±0.027*#△

图1 各组小鼠小肠组织中Perforin mRNA表达电泳图

图2 各组小鼠小肠组织中Perforin蛋白表达电泳图

2.2 各组小鼠小肠组织中Granzyme mRNA及蛋白表达水平

表2、图3～4显示，与N1组比较，N2组、M1组、M2组小鼠小肠组织中Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01);与N2组比较，M1组Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.01或 0.05);与 M1组比较，M2组 GranzymemRNA及蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)。

表2 各组小鼠小肠组织中Granzyme mRNA及蛋白表达水平(±s)

表2 各组小鼠小肠组织中Granzyme mRNA及蛋白表达水平(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0.01;与空白感染白念组比较:##P＜0.05，#P＜0.01;与脾虚模型对照组比较:△P＜0.01

组别 例数Granzyme mRNA Granzyme空 白 对 照 组10 0.125±0.007 0.128±0.008空白感染白念组 10 0.220±0.016* 0.223±0.011*脾虚模型对照组 10 0.198±0.010*# 0.197±0.017*##脾虚感染白念组 10 0.276±0.028*##△ 0.266±0.027*##△

图3 各组小鼠小肠组织中Granzyme mRNA表达电泳图

图4 各组小鼠小肠组织中Granzyme B蛋白表达电泳图

3 讨论

中医学认为，机体先天禀赋不足或后天失养时，脾气不足以完成运化水湿等主要生理功能，机体即可表现为脾虚证。除先天禀赋不足病因外，脾气虚多因饮食不节、劳累过度、久病耗伤脾气所致［3］。本研究采用饮食不节加劳倦过度的复合因素制备脾虚小鼠模型，结果显示脾虚模型组小鼠出现体质量下降、便溏或稀便、食少纳呆、毛色枯槁或蜷缩聚堆、反应迟钝、胆怯状态等表现，提示脾虚模型复制成功。

Perforin和Granzyme是在细胞介导的细胞毒作用中发挥其相关功能的蛋白质，主要由细胞毒T淋巴细胞(CTL)和NK细胞释放，从而产生对靶细胞的攻击作用［4］。Granzyme不能单独进入靶细胞内，它必须在Perforin的作用下，使靶细胞形成孔后才能通过孔进入进而引发凋亡［5］。在CTL和NK细胞的前体细胞内，PFP表达水平很低，然而在激活后表达水平则明显升高［6］。

本研究结果显示，Perforin及Granzyme在小肠组织中表达水平不高。与N1组比较，N2组、M1组、M2组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白的表达水平均有所上调，其中在M2组表达水平上调最为明显。提示脾虚感染白念组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平升高最为显著，说明脾虚加重了机体白色念珠菌感染病情，推测小肠局部黏膜组织中 Perforin和Granzyme高表达水平可能是造成损伤的发生免疫机制之一。

此外据文献报道，Perforin和Granzyme联合使用能够诱发对Fas配体抵抗性的癌细胞凋亡［7］。本研究中Perforin和Granzyme能否诱发小肠黏膜局部细胞凋亡，还有待于进一步研究。

［1］黄柄山，毛翼楷，范隆昌，等.饮食失节所致的脾虚动物模型及中药治疗观察［J］.中西医结合杂志，1983，3(5):295－296.

［2］邹世洁，周永生，樊雅莉，等.脾气虚证动物模型规范化的初步研究宏观症征部分［J］.中国中西医结合消化杂志，2001，9(5):264－267.

［3］韩晓伟，马贤德，侯殿东，等.白念珠菌消化道感染对脾虚小鼠肠组织中IFN－γ mRNA及IL－10 mRNA表达的影响［J］.中华中医药杂志，2015，4:1062－1065.

［4］Griffiths GMet al.Immunol Today，1991，12(11):415.

［5］Shi L，Mai S，Israels S，et al. Granzyme B (GraB) autonomously［J］.J Exp Med，1997，185(5):855－66.

［6］Hishii M，Kurnick J T，Ramirez Montagut T，et al.Studies of the mechanism.by tumor infiltrating lymphocytes［J］.Clin Exp Immunol，1999，116(3):388.

［7］Lefai Eet al［J］.Biochem J，2001，360(1):117.

Effect of intestinal infection of Candida albicans on Granzyme and Perforin in small intestine of spleen deficiency mice

MA Xian－de HAN Xiao－weiGUAN Hong－quan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Objective:To investigate the expression of and Perforin in the small intestine of mice with spleen deficiency and the expression of and Granzyme in the small intestine.Methods:60 healthy SPF mice were randomly divided into two groups:blank group(N group，30 mice);spleen deficiency model group(M group，30 mice).The model of improper diet and overstrain of replication in mice with spleen deficiency syndrome of spleen deficiency model mice.After successful model replication，M and N mice were randomly divided into two groups:control group(N1 group，15 mice);control group(M1，15 mice);spleen deficiency model group(M2，15 mice).N2 and M2 mice were infected with Candida albicans，and the concentration of white fungus was 2×108CFU/ml，and the dose was 0.2 ml/10 g.Twenty－first days after infection，the related indexes were detected.The expression level of Perforin and mRNA was detected by RT－PCR assay，and the expression of and Perforin in the small intestine of mice were detected by Western－blot assay.Granzyme assay was used to detect the expression of and Granzyme.Results:mRNA Perforin and protein expression levels of Perforin，Granzyme Perforin and protein expression levels were compared with the control group.The expression levels of Perforin，mRNA Perforin and protein were significantly increased in mice treated with Granzyme，mRNA and，compared with control group(Granzyme)，Granzyme，mRNA mRNA and protein expression levels were significantly increased in spleen deficiency model group(Granzyme).Conclusion:the high expression of Granzyme and Perforin may be one of the mechanisms of local damage in small intestine mucosa.

spleen deficiency;Candida albicans;infection;perforation;granule enzyme.

R285.5

:B

:1006－3250(2015)12－1519－03

2014－02－24

国家自然科学基金资助项目(81173145);辽宁中医药大学省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室

马贤德(1979－)，在读博士，从事中医药抗感染免疫的临床与研究。

△通讯作者:关洪全(1954－)，博士研究生导师，从事中医药对虚证调控的临床与研究，E－mail:hongquanguan@sina.com。