黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

王丹丹,周晨妍,李同彪,张振群,王亚杰,梁真真,张 青,路丹荣

(1.新乡医学院生命科学技术学院,河南新乡 453003;2.新乡医学院三全学院,河南新乡453003)

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

王丹丹1,2,周晨妍1,*,李同彪1,张振群1,王亚杰1,梁真真1,张 青1,路丹荣1

(1.新乡医学院生命科学技术学院,河南新乡 453003;2.新乡医学院三全学院,河南新乡453003)

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2(成熟肽碱基)插入表达载体pPIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用pH为5.0,在温度35～40℃、pH5～7条件下有良好的稳定性,Ca2+对酶的激活作用最明显。

黑曲霉,木聚糖酶,毕赤酵母GS115,诱导表达

木聚糖酶(Xylanase)[EC3.2.1.8]是指将木聚糖降解为低聚糖和木糖的一类酶的总称,是木聚糖降解酶系中最为关键的酶[1-3]。近年来该酶在食品、能源、饲料、造纸工业及环境等领域均有了广泛的应用,具有很高的经济价值。产木聚糖酶的微生物分布很广,包括放线菌、真菌、细菌和一些酵母等[4-6]。不同种类,不同来源的木聚糖酶显示出不同的催化特性,使用各种手段来提高该酶的产量并降低其生产成本,挖掘出其潜力并应用到实际生产中去是亟待解决的问题。

在前期的实验中我们已经从黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因xynZF-2,并且在大肠杆菌中进行了可溶性表达,但是表达量不高并且为胞内表达[7]。本研究在此基础上将xynZF-2克隆到真核表达载体上并在毕赤酵母中进行分泌表达,并对其所产重组木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

pET-28a-xynZF-2重组载体 新乡医学院生命科学技术学院酶与发酵工程实验室构建保存;大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115、表达质粒pPIC9K 均购自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4DNA连接酶、SalⅠ酶 均购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒 均购自上海生工生物有限公司;桦木木聚糖(Birch wood xylan) 购自Sigma公司;无氨基酸酵母氮源(YNB)、G418 购自Amresco公司;其他生化试剂 均为进口或国产分析纯;LB、YPD、MD、BMGY(富集培养基)、BMMY(诱导培养基)配制方法见参考文献[8]。

HZQ-F160A恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;梯度PCR扩增仪 C1000 Bio-Rad Laboratory;DC-0506低温恒温槽() 上海比朗仪器有限公司;稳压稳流电泳仪(DYY-2) 北京市六一仪器厂;高速冷冻离心机(Neofuge 23R) 上海力申科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PCR引物设计及合成 根据xynZF-2基因的序列以及表达载体pPIC9K上多克隆位点的特征,设计并合成以下一对引物:P1:5′-CCGGAATTC GTTCCCCACGACTCTGTCG-3′(EcoRⅠ);P2:5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTG AACAGTGATGGA-3′(NotⅠ)。

1.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建 PCR扩增得到的木聚糖酶基因xynZF-2,经琼脂糖凝胶回收纯化,并与表达载体pPIC9K同时用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切。回收并纯化双酶切后的xynZF-2基因和pPIC9K载体片段,经T4DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,用含卡那霉素LB平板筛选阳性克隆子。提取质粒后,用限制性内切酶进行双酶切并通过测序来验证插入基因片段是否正确,最后得到pPIC9K-xynZF-2。

1.2.3 重组毕赤酵母的构建及高拷贝转化子的筛选 用SalⅠ酶切重组质粒pPIC9K-xynZF-2以及对照空载体pPIC9K,琼脂糖凝胶回收纯化目的片段并分别电击转化毕赤酵母GS115中,电击转化方法参照Invitrogen公司操作手册。利用MD平板筛选出阳性克隆子,并在含有不同G418浓度的(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0、8.0mg/mL)的YPD培养基平板上进行高拷贝转化子的筛选,最后摇瓶复筛得到一株木聚糖酶高产菌株(编号65#)。

1.2.4 重组毕赤酵母工程菌株的摇瓶培养及诱导表达 挑取编号为65#的菌株,接种于含有20mL BMGY培养基的250mL的三角瓶中,30℃,250r/min培养至A600为6.0左右,离心收集菌体,转接至装有20mL BMMY培养基的250mL三角瓶中,相同条件下继续培养,每24h补加100%甲醇至终浓度为0.5%,诱导表达3～5d。

1.2.5 表达产物的纯化和SDS-PAGE分析 重组转化子GS115/pPIC9K-xynZF-2诱导培养96h,3000r/min离心10min,取发酵上清液聚乙二醇浓缩,透析纯化后进行12% SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色,检测目的蛋白的表达。

1.2.6 木聚糖比酶活的测定 采用改进的DNS法[9]测定木聚糖酶活力。酶活单位的定义:在50℃和pH4.6条件下,以0.5%桦木木聚糖作为底物,以每分钟产生1μmol木糖所需的酶量为1个酶活单位。

用Bradford法[10]测定蛋白质浓度,以牛血清白蛋白作为标准蛋白。

酶的比活(U/mg)=酶活性/蛋白浓度。

1.2.7 发酵条件优化 将种子培养液按体积分数1%接种量接种于30mL生长培养基BMGY中培养全部转接发酵培养基BMMY中,同时按体积分数0.5%添加甲醇,并每隔24h补加甲醇一次,在30℃的恒温摇床中振荡培养,转速为240r/min,分别调整发酵培养基接种时间、甲醇诱导浓度、诱导时间等因素进行发酵培养。

1.2.8 酶学性质的测定 酶的最适作用温度和pH以及热稳定性和pH稳定性的具体实验操作方法见参考文献[7],反应所用缓冲液浓度分别为0.05mol/mL的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0),Tris-盐酸缓冲液(pH8.0),磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0～7.0)和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0～5.0)。

金属离子对酶活性的影响:将酶在最适的pH体系下40℃保温1h,然后进行最终浓度为1mmol/L化合物和金属离子对酶活性影响的实验。以标准方法测定酶活力,以不加金属离子的酶活性为100%,计算相对酶活。

1.2.9 酶学动力学参数测定 在酶促反应的最适条件下,以0.5%桦木木聚糖为底物,依次在酶促反应的2、4、6、8、10、15、20、25、30min时终止反应,测定木聚糖酶活性,计算出酶促反应的一级反应时间,确定测定Km值及Vmax的反应时间为20min。以浓度分别为1～10mg/mL的桦木木聚糖为底物,在最适条件下测定酶活活性,计算出相应的反应速度,并利用米氏方程双倒数法求得Km值及Vmax。

1.2.10 统计学处理 实验数据均用Excel办公软件和SPSS11.0软件进行处理,并绘制出相应的变化曲线。

2 结果与分析

2.1 毕赤酵母重组表达载体的构建

以pET-28a-xynZF-2为模板,以P1/P2为引物进行PCR扩增得到xynZF-2基因(图1)。

图1 PCR扩增产物凝胶电泳分析Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR product注:M:DL2000 DNA Marker;1:xynZF-2 PCR扩增产物

将xynZF-2以正确的阅读框架插入到酵母表达载体pPIC9K的α-因子信号肽的下游,得到重组表达载体pPIC9K-xynZF-2。经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定(图2),并测序正确后确定重组质粒构建正确。

图2 重组质粒pPIC9K-xynZF-2的双酶切验证Fig.2 The restriction analysis of recombinant plasmid pPIC9K-xynZF-2注:M:DL2000 DNA Marker;1:xynZF-2 PCR扩增产物;2:EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pPIC9K-xynZF-2。

2.2 重组毕赤酵母的构建及高拷贝转化子的筛选

重组表达载体pPIC9K-xynZF-2经SalⅠ线性化以后电击转化毕赤酵母感受态细胞GS115中,将转化液体涂布MD平板筛选出阳性克隆子。另外,表达载体pPIC9K上含有卡那霉素G418药物的抗性基因,并且相关研究认为G418抗性与重组转化子的拷贝数呈正相关关系。因此,可以直接用含有高浓度G418的YPD快捷方便的筛选出含重组载体pPIC9K-xynZF-2多拷贝的重组菌株。

将在MD平板上筛选的阳性转化子在含有不同浓度G418的YPD平板上进一步筛选出高拷贝转化子,最终在8.00mg/mL G418的YPD平板上筛选得到四十多个高拷贝转化子。摇瓶复筛,得到一株高产木聚糖酶的重组毕赤酵母菌株(PichiapastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#)。

2.3 重组蛋白的诱导表达和条件优化

2.3.1 接种时间的优化 将P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#进行甲醇诱导表达,并对其发酵条件进行优化。在发酵过程中,种子的选择非常关键,种龄太短,发酵过程会出现前期生长缓慢,致使周期延长,甚至造成异常发酵;种龄过长,会引起菌体过早自溶,导致生产能力下降。图3结果显示接种时间选择在对数生长期的28h(A600=16.0)时,比酶活最高。

图3 接种时间对产酶的影响Fig.3 Effect of inoculation time on xylanase production

2.3.2 甲醇诱导时间的优化 图4结果表明,诱导表达前期随着时间的延长,表达量增大,在诱导96h时达到最大,接着随着时间的进一步增加,产酶量依次递减。

图4 甲醇诱导时间对产酶的影响Fig.4 Effect of induction time on xylanase production

2.3.3 甲醇诱导浓度的优化 甲醇能够诱导重组毕赤酵母表达,但是并不是随着甲醇浓度的增加表达量就随之增加,图5结果表明,甲醇浓度在1.5%时诱导表达量最大,浓度过大对诱导表达反而起抑制作用。

图5 甲醇浓度对产酶的影响Fig.5 Effect of methanol concentration on xylanase production

2.4 重组木聚糖酶的SDS-PAGE

将P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#诱导表达发酵液上清与上样缓冲液煮沸10min后3000r/min离心5min,然后SDS-PAGE电泳,结果(图6)显示,重组菌株在23.0ku左右处有一明显条带,并且大小与预测蛋白分子量相符,除目的蛋白外,基本上无杂带,能够满足后期酶学性质分析。

图6 重组表达木聚糖酶SDS-PAGE分析Fig.6 Analysis of recombinant expressed xylanase by SDS-PAGE注:M:蛋白分子量标准;1:GS115/pPIC9K-xynZF-2 65#诱导纯化。

2.5 重组木聚糖酶酶学性质

2.5.1 重组木聚糖酶最适作用温度和温度稳定性 由图7可以看出,该重组木聚糖酶作用最适温度为45℃,温度过高或者过低对重组酶活性都有不同程度的影响。图8结果显示,重组酶在35℃和40℃条件下稳定性良好,在此温度下保温1h以后相对酶活性仍然能够保持在70%以上;随着温度的升高,重组酶的稳定性越来越差,45℃和50℃条件下保温30min以后,相对酶活性降到10%以下,说明该重组酶的耐热性不好,有待进一步提高。

图7 温度对重组木聚糖酶酶活性的影响Fig.7 The effect of temperature on xylanase activity

图8 重组木聚糖酶的温度稳定性Fig.8 The thermostability of the xylanase

2.5.2 重组木聚糖酶最适作用pH和pH稳定性 图9结果显示该重组酶的最适作用pH为5.0,作用环境偏酸,过酸或者偏碱对酶活性都有强烈的抑制作用。将该重组酶在不同的pH条件下保温1h以后,在pH5.0～7.0之间,相对酶活性仍然能够保持在60%以上,过酸或者偏碱都有可能影响重组酶蛋白质分子的构象,进而来影响酶的活性,相对酶活性降到30%以下。

图9 pH对重组酶活性的影响及重组木聚糖酶的pH稳定性Fig.9 The effect of pH on activity and stability of the recombinant xylanase

2.5.3 金属离子对酶活性的影响 将重组木聚糖酶与不同的金属离子保温一段时间以后,酶活性均有不同程度的改变,图10结果显示,Zn2+、Ca2+、Fe2+、EDTA对该重组酶有不同程度的激活作用,其中Ca2+激活作用最强,其余常见离子对重组酶活性有不同程度的抑制作用,尤其是与Cu2+保温之后,相对酶活性仅仅保留在50%左右,与原核细胞中表达的酶性质大有不同[7],其机制有待进一步研究。

图10 金属离子对重组酶活性的影响Fig.10 The effect of metal ions on recombinant xylanase

2.6 重组酶酶学动力学参数测定

在酶促反应的最适条件下,以0.5%桦木木聚糖为底物,依次在酶促反应的2、4、6、8、10、15、20、25、30min时终止反应,测定木聚糖酶活性,计算出酶促反应的一级反应时间,确定测定Km值及Vmax的反应时间为20min。以浓度分别为1～10mg/mL的桦木木聚糖为底物,在最适条件下测定酶活活性,计算出相应的反应速度,并利用米氏方程双倒数法求得Km值及Vmax。该重组木聚糖酶的动力学参数的测定结果为Vmax=2500μmol/mL/min,Km=1.5mg/L。

3 讨论

毕赤酵母表达系统是近年来国内外公认的最有效的新型外源蛋白表达系统之一,该表达系统具有高效表达、高稳定性、高效分泌、高密度发酵以及很容易被用于大规模生产等优点,已有多种外源蛋白在毕赤酵母中获得了成功的表达[11-14]。

本研究将从黑曲霉XZ-3S中克隆得到的木聚糖酶基因xynZF-2插入到真核表达载体pPIC9K上,在α-因子分泌信号的下游,利用AOX1高效启动子的作用使目的基因在毕赤酵母中得到了高效的外分泌表达。抗生素G418筛选得到高拷贝转化子以后,对其发酵条件进行优化,得到重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#并且表达木聚糖酶产量可达13210U/mg,远远高于原始出发菌株和大肠杆菌原核表达菌株。该菌株表达的目的蛋白具有很好的生物学活性,为木聚糖酶的工业化生产提供了良好的出发菌株,在后续实验中需要对该菌株在发酵罐中进行扩大培养。

酶学性质研究结果表明,该重组木聚糖酶的最适作用温度为45℃,较大肠杆菌原核表达稍有一定的提高;最适的作用pH为5.0,与原核表达相比差别不大;在温度35～40℃、pH5～7条件下稳定性良好,在保温1h以后酶活仍能保留在60%以上,热稳定性和耐酸性比原核表达均有了一定程度的提高;Ca2+对该酶的作用有很强的促进作用,Cu2+抑制作用最强,大肠杆菌表达过程中Fe3+激活作用最明显,二者差别的机制有待进一步研究[7]。木聚糖酶在饲料、漂白等行业应用广泛,但是在这些行业的应用过程中对温度和pH等环境都有不同严格要求,该重组酶在毕赤酵母中表达良好,但是此酶的最适作用pH环境偏酸,并且耐热性不好,离工业化生产使用仍然有一定的差距[4,15]。故下一步的工作将对该重组酶的热稳定性和pH稳定性进行改造来扩大该重组木聚糖酶的应用范围,为其工业化应用开发奠定良好的基础。

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Efficient expression of the xylanase genexynZF-2 fromAspergillusnigerXZ-3S inPichiapastoris

WANG Dan-dan1,2,ZHOU Chen-yan1,*,LI Tong-biao1,ZHANG Zhen-qun1,WANG Ya-jie1,LIANG Zhen-zhen1,ZHANG Qing1,LU Dan-rong1

(1. School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China;2. San Quan Medlcal College,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China)

In this study,a recombinant plasmid pPIC9K-xynZF-2was constructed by inserting genexynZF-2 mature peptide)fromAspergillusnigerintoPichiapastorissecretary vector pPIC9K. The pPIC9K-xynZF-2 linearized bySalⅠwas transformed intoPichiapastorisGS115 by electroporation. The positive recombinant strain was identified by MD medium,G418 and shake bottle selection. The SDS-PAGE analysis showed that the protein molecular weight was about 23.0ku. Under the condition of the vaccination time 28h,1.5% methanol every 24h added,and the methanol induced time 96h,the enzyme production can be achieved 13210U/mg. The optimal temperature and pH of the enzyme activity was 45℃ and 5.0,respectively. The enzyme activity was stable at the conditions of temperature 35～40℃ and pH 5～7. Ca2+had an active effect on the enzyme obviously.

Aspergillusniger;xylanase;PichiapastorisGS115;induction expression

2014-05-19

王丹丹(1988-)，女，硕士，助教，主要从事微生物酶工程研究。

*通讯作者:周晨妍(1979-)，女，博士，副教授，主要从事微生物酶工程研究。

河南省教育厅自然科学研究计划项目资助(2011A180026)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A180861)；河南省科技厅科技攻关项目(112102210299)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(2011GGJS-125)；新乡医学院科研项目培育基金(2013ZD113)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.034