超声波处理对荞麦种子营养物质累积以及抗氧化活性的影响

张冬晨,刘海杰,刘 瑞,郝建雄

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018)

超声波处理对荞麦种子营养物质累积以及抗氧化活性的影响

张冬晨1,刘海杰1,刘 瑞1,郝建雄2,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050018)

采用超声波对荞麦种子进行预处理,测定其萌发率,比较了萌发过程中水分含量、可溶性糖、粗蛋白、总酚和总黄酮的含量,以及体外抗氧化活性的变化。结果表明:10～20min的超声波处理可以提高荞麦的发芽率,而且萌发后荞麦芽的品质有所提高,其抗氧化物质有一定程度的累积,体外抗氧化活性增强。其中以超声波处理20min效果最理想,发芽率提高至94%,总酚含量达到180.8μg GAE/mL,总黄酮含量为156.701mg芦丁/g 样品,DPPH自由基清除活力达到最大值(0.197mg Trolox eq/g冻干样)。荞麦萌发之前采用适宜的短时间的超声波处理,不仅能促进萌发,还能促进其抗氧化能力的提高。

超声波,荞麦,营养物质累积,抗氧化

荞麦属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属,主要有甜荞(FagopyrumesculentumMoench)和苦荞(FagopyrumtaraicumGaerth)两个品种。荞麦含有丰富的蛋白、碳水化合物、不饱和脂肪酸及维生素,尤其是叶绿素和黄酮类化合物,如芦丁和槲皮素等。荞麦中的黄酮类化合物具有多种生理功能,如抗氧化性、清除自由基、抗衰老等。荞麦籽粒萌发,不仅能降低胰蛋白酶抑制剂的活性,还能抑制芦丁降解,发挥荞麦的保健功效。而且作为一种营养丰富的新型蔬菜,鲜嫩可口。但是荞麦发芽过程中发芽率较低,易感染微生物等问题阻碍了其在生产生活中推广。

超声波发展于20世纪,在各领域应用中展现出独特的作用,引起了国内外学者的普遍关注。当超声波在介质中传播时,超声波与两相或多相介质相互作用,使介质发生物理和化学的变化,从而产生一系列力学、热学、电磁学和化学的超声效应[1-2]。对食品进行超声波处理将引起食品成分的物理和化学变化。超声波处理可以降解大分子,使其发生机械性断键以及自由基的氧化还原[3]。此外,还可以提高肉品品质,促进酵母繁殖,缩短发酵时间,增加酒香[4-5]。食品行业中,超声波还普遍应用于提取,杀菌,食品添加剂的合成,干燥除气,结晶冷冻,乳化均质等。近年来,超声波作为一种无公害的物理处理手段在生物科学领域已得到了广泛的应用,植物种子经超声波处理后,破坏植物细胞和细胞膜结构,从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力,提高活力、促进萌发及幼苗的生长、增加抗逆能力及作物产量[6-7]。

本研究采用超声波处理荞麦种子,研究其对发芽率的影响,并考察了营养物质尤其是黄酮类的含量变化以及体外抗氧化情况的影响,以期找到一种既能促进种子萌发又能提高营养价值的荞麦芽生产新技术。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜荞种子 太谷县晋农瓜菜种子服务部;芦丁标准品 美国Sigma-Aldrich公司,分析纯,98%;抗坏血酸 美国Sigma-Aldrich公司,分析纯,≥99%;其他试剂 均为分析纯。

超声波清洗仪KQ-600DE 昆山市超声仪器有限公司;凯氏定氮仪KYD-9820 北京市通润源机电技术有限公司;真空冷冻干燥机LGJ-18 北京四环科学仪器厂;台式离心机TDL-40B 上海安亭科学仪器厂;紫外-可见分光光度计UV-1600 日本岛津公司;微孔板混合器NS-P 日本ASONE;酶标仪model 550 美国Bio-Rad Laboratories;回旋振荡器WSZ-100A 上海一恒科技有限公司;高速均质机T25basic 德国IKA Labortechnik。

1.2 实验方法

1.2.1 荞麦芽样品准备 取颗粒饱满、无生理缺陷、大小均一的荞麦(20±1)g,用自来水洗涤1 遍,加入 60mL蒸馏水,放入恒温发芽培养箱中。在 25℃,湿度为80%条件下浸泡 6h,然后放入超声波清洗仪中进行处理(工作频率:40kHz;超声功率480W;温度:24℃),处理时间设置为10、15、20、25、30min 5个组,3次重复。以不用超声处理的实验组(0min)为对照组。最后将经过预处理的实验样品放入 25℃恒温培养箱中进行培养。每8h淋浇一次水。一次浇水量为100mL。至第9d结束。冻干,磨成粉,备用。

1.2.2 发芽率测定 自开始培养起,每隔12h,依次测量其发芽率(胚轴突破种皮 1mm 即为萌发),连续测定3d,每组重复 3次,直至个别处理组发芽率达到100%。

1.2.3 水分含量的测定 参照国标GB/T 5009.3-2010,测定各处理组荞麦芽鲜样的水分含量。

1.2.4 可溶性糖含量的测定 参照蒽酮比色法测定各处理荞麦芽的冻干样的可溶性糖含量。

1.2.5 粗蛋白含量的测定 参照国标GB/T 5511-2008,测定各处理组荞麦芽的冻干样的粗蛋白含量。

1.2.6 总酚类的测定 根据福林-酚比色法[8],准确称取荞麦芽样品1.0000g(精确至0.0001g),分别加入100mL 80%乙醇,室温下过夜振荡提取(100r/min),过滤提取液,定容至100mL,0.45μm有机膜过滤后,待测定。

取50μL样品,加入Folin-Ciocalteu稀释试剂 1.0mL,7.5% Na2CO3溶液1.0mL,用蒸馏水定容5mL,在室温下静置30min,765nm比色测定,试剂空白为参比。以没食子酸绘制标准曲线。结果以每毫升溶液中没食子酸(GAE)当量表示样品中总酚含量。

1.2.7 氯化铝法测定总黄酮含量 参照Balbaa[9]的方法,取待测样品的冻干样0.2g置于50mL圆底烧瓶中,加入25mL甲醇加热回流提取1h,趁热过滤,置于50mL容量瓶中,滤纸滤渣再加20mL甲醇加热回流30min,合并滤液,用甲醇定容至50mL。取2.5mL提取液,依次加入5mL 50%乙醇,3mL 25g/L AlCl3和5mL 100g/L乙酸钠。用50%乙醇定容至25mL,40min后在417nm下测定吸光值,以芦丁标准液绘制标准曲线。

1.2.8 还原力的测定 样品前处理:1g样品冻干粉,加入20mL蒸馏水,16000r/min均质2min,悬浊液煮沸15min以钝化酶活,然后与60℃水浴摇床中150r/min下震荡提取1h。之后于3800r/min转速下离心15min,取上清液并用0.45μm微孔水系滤膜过滤,得到样品水提物,4℃保存备用。

还原力的测定参考Oyaizu[10]的方法。以0.5mg/mL的VC作为比较标准。

1.2.9 DPPH自由基清除活性的测定 样品前处理方法同1.2.8的前处理方法。DPPH自由基清除活性的测定根据改进的Fenglin检测方法进行[11],结果表示为mg Trolox eq/g冻干粉。

1.2.10 数据分析与处理 实验结果均采用三次重复的平均值,每次重复的平行至少三个。作图采用Microsoft Excel 2013和Graphpad Prism 5,用SPSS进行Duncan方差分析,结果以平均值±方差的形式表示。显著性水平为p<0.05。

2 结果与讨论

2.1 超声波处理对荞麦芽的发芽率的影响

图1 表示的是不同超声波前处理时间对荞麦发芽率的影响。由图中可以看出,随着发芽时间的延长,超声波处理20min的处理组发芽率一直高于其他几个处理组,在60h发芽率几乎达100%,15min处理组的发芽率也较高,其他几个处理组的发芽情况均比对照组差。这说明,超声波处理20min的效果最好。

图1 超声波处理对发芽率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic treatment on germination rates of buckwheat sprouts

少量的超声波能刺激细胞分裂,中等量的超声波会抑制细胞分裂,大量的能引起细胞死亡,长时间、大剂量的超声波处理则会造成负面的不可逆的影响[12]。Maryam Yaldagard[13]用超声波处理大麦种子,发现处理组(处理时间为5～15min)的发芽率高于未处理组,同时也缩短了大麦种子的发芽期,尤其以处理15min效果最明显。也有人曾经用超声波处理白菜和菠菜种子,发芽率达到96%,而未处理组能达到88%。本实验中,荞麦种子本身发芽率较低,未处理组发芽率仅为60%左右,20min超声波处理组发芽率超过90%,远远高于未处理组。而30min超声波处理组发芽率仅仅为50%,这可能主要是因为,超声波处理时间为10～20min时,处理时间短,因而起到少量的刺激作用,使15、20min处理组的发芽率高于未处理组,25、30min处理组由于处理时间长而导致超声波对种子起到破坏作用,因而发芽率低于未处理组。

2.2 超声波处理对荞麦芽水分、可溶性糖和粗蛋白含量的影响

发芽是将有活性的荞麦种子从休眠的静态跃升为生理活动频繁的动态的过程,此时呼吸作用增强,酶的种类和数量显著增加,酶活性的加强使其新陈代谢在较高水平上进行,同时启动大量酶促反应进行生物转化,储存的各种物质被转化和提升为可供新生命利用的高活性成分,使生物活性物质含量显著增加。

由图2a可以看出,与对照组相比,不同超声波处理时间(10～25min)的处理组的水分含量显著差异(p<0.05)。其中,10～25min处理组的水分含量显著地高于对照组,并在20min处达到最高值(91.66%);30min处理组与对照相比并无显著性差异,水分含量达最小值(87.62%)。

图2b是不同超声波处理时间对荞麦芽可溶性糖含量的影响。处理组之间差异显著(p<0.05)。其中在30min处达到最大值(6.54%),在20min处达最小值(3.63%)。与水分含量整体变化趋势相反。碳水化合物是荞麦中的主要营养成分,荞麦种子中主要的碳水化合物是淀粉。随着种子的萌发,其淀粉酶活性增强,淀粉被分解为可溶性的糖类(二糖、三糖、四糖等),其含量增加,后期可溶性糖被分解,成为小分子的游离糖(主要为葡萄糖、果糖),此时可溶性糖含量逐渐降低,游离糖含量相应升高,在种子的呼吸作用中被消耗。Kim Sum-lim等人[14]研究报道,随着荞麦发芽时间的延长,二糖、三糖和四糖的数量逐渐减少,单糖(主要为葡萄糖和果糖)含量快速增加,至发芽第8d时,葡萄糖和果糖的含量分别为2.46、1.67g/100g。

图2c中超声波处理后,荞麦芽的粗蛋白没有显著性差异(p>0.05)。处理组之间总的含氮物质并没有随着超声波处理时间的不同而发生变化。所以超声波处理对与荞麦芽的粗蛋白含量影响不大。

数据采集系统主要由上位机、485主站单元和31个485从站单元组成,原理框图如图1所示。上位机和主站单元通过以太网接口通信,主站单元建立485总线,其内部的FPGA解析上位机下发的命令后转发到RS-485总线上,与某一从站单元匹配成功后进行通信,并将接收的数据经处理打包后上传至上位机。根据命令可更改从站单元之间的查询模式,实现了一主站多子站间的高速485通信。

图2 超声波处理对荞麦芽基本营养成分的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on basic nutrition compositions of buckwheat sprouts注:相同字母表示差异性不显著(p>0.05),不同字母表示差异性显著(p<0.05),图3～图6同。

发芽使种子的营养价值得以提高。由以上三种基本营养成分的变化可以看出,20min处理组种子的营养情况最好,30min处理组种子的营养情况最差。但是总体上来看,处理时间为10～20min的处理组与空白相比,营养成分均有所改善,而大于20min的处理组(25、30min)营养成分与空白组相比不及空白组。赵萌萌等[15]研究了超声波处理对黄豆种子品质的影响,研究发现,一定时间的超声波处理对黄豆萌发率、发芽指数等均有促进作用,对萌发后黄豆芽的品质具有增益效应,其中以超声波处理25min效果最理想。这可能是由于种子不同,其种皮厚度、成分等均有所不同,因而最适宜的处理条件也略有差异。

2.3 超声波处理对于荞麦芽的抗氧化的影响

2.3.1 超声波处理对于荞麦芽的总酚含量的影响 荞麦种子中酚类物质含量丰富,发芽过程会使荞麦种子中的总酚含量增加[16]。

图3表示的是不同超声波处理后荞麦芽中总酚含量的变化情况。由图3可以看出,与对照组相比,采用超声波对荞麦种子进行前处理后,其发芽后总酚含量有显著性差异(p<0.05)。其中,处理时间为10～20min的处理组,总酚含量高于对照组,并且在20min处达到最大值(180.8μg GAE/mL)。处理时间>20min的处理组,总酚含量显著低于对照组(p<0.05),并且在30min达到最小值(129.8μg GAE/mL)。

图3 超声波处理对荞麦芽总酚含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment on phenolic composition content of buckwheat sprouts

2.3.2 超声波处理对于荞麦芽的总黄酮含量的影响 黄酮类化合物是荞麦多酚最主要的成分,是荞麦中最重要的生物活性物质,赋予荞麦众多的生理功能。国内外学者对荞麦的壳、全籽粒、糊粉层、叶、茎、花中生活类黄酮资源的化学组成、抗氧化性和稳定性进行了大量研究[17-18]。

芦丁是荞麦黄酮类化合物的主要组成部分,也是荞麦黄酮类物质最突出的。此外,槲皮素也是荞麦中一种重要的黄酮类化合物。萌发处理可以克服芦丁的降解,使其含量显著增加,同时提高其利用率。它们的抗氧化性的检测方法众多,此方面的报道也比较多,此外,荞麦黄酮的抗氧化、抗高血压、抗炎活性也是人们研究的一部分[19-21]。

图4表示不同超声处理时间对于荞麦芽的总黄酮含量的影响。本实验中测得荞麦芽的总黄酮含量与相关文献中报道的荞麦芽的总黄酮含量相一致[22]。由图4可以看出,与对照组相比,各处理均有显著性差异(p<0.05)。其中,当处理时间为10～20min时,总黄酮含量显著增高,其中在20min处取得最高值(156.70mg芦丁/g 样品)。当处理时间为25～30min时,总黄酮含量显著低于对照组,并且在30min处取得最小值(116.84 mg芦丁/g 样品)。

图4 超声波处理对荞麦芽的总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic treatment on total flavonoids of buckwheat sprouts

前人研究表明[23-24],长时间日照、适宜的温度、钙离子水溶液均能促进荞麦中黄酮类物质的合成。任顺成[22,25]发现,荞麦芽中的黄酮类物质在发芽第7d可达最大值,约为120mg 芦丁/g 样品。本研究固定荞麦发芽的环境,改变超声波处理时间,黄酮类化合物的含量升高,其中最大值为156.70mg芦丁/g 样品,显著高于其他处理组。这可能是由于超声波的空化作用引起的热效应有利于荞麦的发芽。此外,超声波在低强度及适宜频率条件下具有空穴作用、磁致伸缩作用和机械振荡作用,改变酶分子构象,促进细胞代谢过程中底物与酶接触,促进产物的释放,从而增加酶的生物活性[6]。苯丙氨酸解氨酶是黄酮类合成过程中的关键性限速酶,种子中的苯丙氨酸解氨酶活性升高,因此黄酮的含量升高。而过长时间的超声波处理,则会导致黄酮的分解,促进其氧化还原反应的发生,因此,长时间(25～30min)的超声波处理降低了荞麦芽的抗氧化能力。

图5 超声波处理对荞麦芽的总还原力的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on reducing power of buckwheat sprouts

2.3.4 超声波处理对DPPH自由基清除活性的影响 荞麦芽的DPPH自由基清除活性如图6所示,与对照组相比,10～20min处理组DPPH自由基清除活性有显著差异(p<0.05)。其中,处理时间为20min时达到最大值(0.197mg Trolox eq/g冻干样),30min时达最小值(0.119mg Trolox eq/g冻干样)。

图6 超声波处理对于荞麦芽的DPPH自由基清除活性的影响Fig.6 Effects of ultrasonic treatment on DPPH scavenging activity of buckwheat sprouts

与对照组相比,10～20min的超声波处理整体上呈一个上升的趋势,实验测得的荞麦芽的总酚含量、总黄酮含量、还原力以及DPPH自由基清除活性均提高,尤其以20min的处理组最高。这说明采用超声波处理荞麦种子在一定的时间内可以提高芽的抗氧化性,这主要是因为苯丙氨酸解氨酶的活性以及其底物苯基丙氨酸的含量升高,促进其代谢产物黄酮的生成时间[26]。过长的超声波处理总酚含量,总黄酮含量还原力和DPPH自由基清除活性都明显降低,这是由于过长时间的超声波处理使种子的活性降低,酶失活,因而黄酮类的含量降低。Chen Yi-ping[27]等发现超声波可以通过增强小麦种子的抗氧化酶系的活性从而清除ROS(活性氧族)。赵萌萌[15]等研究发现超声波处理,尤其是超声处理25min可以显著增强黄豆中黄酮的含量。本研究中,超声波处理的最适宜时间为20min,此时荞麦的抗氧化能力显著增强,这可能是因为,超声波处理的空化作用引起的机械效应和热效应等,使荞麦种子温度升高,种皮破裂,水分易渗透,苯丙氨酸解氨酶活性提高,从而可以使黄酮类物质得到富集,提高其抗氧化能力,但是不同种子最适宜的处理时间不同。

3 结论

本研究主要检测了用超声波对荞麦种子进行前处理,不同时间对种子的发芽情况、发芽后营养成分的含量以及抗氧化情况的影响。对于荞麦种子来说,20min以内(10～20min)的超声波处理之后并没有明显改善其发芽情况,但是可以提高荞麦芽的营养品质:显著提高其水分含量,可直接供种子呼吸所需要的单糖(葡萄糖、果糖)含量,降低可溶性糖含量。此外,还可以富集具有抗氧化性的黄酮类化合物,提高其抗氧化能力,尤其以处理时间为20min达到最佳状态。但是当处理时间超过20min时,从发芽情况,营养成分的含量以及抗氧化情况来说,种子均不处于良好状态。因而长时间的超声波处理对于荞麦种子来说是不利的。因此,采用适宜短时间的超声波处理荞麦芽可以改善其发芽情况以及抗氧化情况,一方面其可作为日常可使用的芽菜深入大众生活,另一方面其抗氧化性可以促进其作为营养保健品投放市场。

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Effect of ultrasonic treatment on nutritional accumulation and antioxidant activity of common buckwheat

ZHANG Dong-chen1,LIU Hai-jie1,LIU Rui1,HAO Jian-xiong2,*

(1.Colleague of Food Science and Nutritional Engineering,China Agriculture University,Beijing 100083,China;2.Colleague of Life Science and Engineering,Hebei Technology University,Shijiazhuang 050018,China)

To determine the effect of ultrasonic treatment on buckwheat sprouts,the common buckwheat seeds were pretreated with ultrasonic in different time. The germination rate,as well as the content of water,soluble sugar,crude protein,phenolic composition and total flavonoids were determined. Meanwhile,their antioxidant activities(reducing power and DPPH radical scavenging activity)were determined and then compared. The results showed that a certain time(10～20min)treatment could promote germination rate,all the determined nutritional composition and the antioxidant activities. The treatment with 20min had the best antioxidant results with the total phenol content was up to 180.8μg GAE/mL,the total flavonoids content was 156.701 mg rutin/g sample and the DPPH radical scavenging activity had a maximum value. Meanwhile,the treatment also increased the germination rate,which was 94%. Therefore,a proper and short-time ultrasonic treatment do well to the germination and antioxidant activity.

ultrasonic;common buckwheat;nutritional accumulation;antioxidant activity

2014-06-11

张冬晨(1990-)，女，硕士研究生，主要从事食品加工新技能方面的研究。

*通讯作者:郝建雄(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工新技术。

国家自然科学基金资助项目(31201437)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD29B04-1-1)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)07-0069-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.005