PMP-HPLC-MS分析扇贝内脏多糖的组成

黄 璐,王洪旭,殷 廷,曹九零,温成荣,宋 爽

(大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034)

PMP-HPLC-MS分析扇贝内脏多糖的组成

黄 璐,王洪旭,殷 廷,曹九零,温成荣,宋 爽*

(大连工业大学食品学院,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034)

本研究以虾夷扇贝加工副产物内脏为原料制备多糖,采用化学方法测定虾夷扇贝内脏多糖(SVP)中蛋白质含量为4.09%,中性糖含量为75.37%,硫酸根含量为0.63%,硫酸多糖含量为8.77%,红外光谱显示了多糖特征吸收峰。采用PMP-HPLC-PDA-MS分析扇贝内脏多糖酸降解产物,确定主要组成单糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外还含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc;并由二糖片段推测扇贝内脏中存在硫酸软骨素或其类似物,以及三种结构中存在糖醛酸与己糖重复二糖片段的多糖。本研究提供了扇贝内脏多糖的信息,有助于这一加工副产物的开发利用。

扇贝,内脏,多糖,PMP-HPLC-MS

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)是贝类水产品的重要品种,可加工贝柱和柱连籽产品,而内脏是加工的副产物,作为低值饲料使用甚至被丢弃。殷红玲等[1]对虾夷扇贝内脏多糖的酶解提取方法进行了优化,并证实提取出的虾夷扇贝内脏多糖具有羟基自由基清除活性。闫雪等[2]从虾夷扇贝内脏中提取纯化得到的多糖组分SVP-12,并测定了它的硫酸根含量,氨基己糖含量,分子质量,气相色谱法分析了单糖组成。李广靖等[3]从虾夷扇贝软体部下脚料中提取出糖胺聚糖,并证实它具有一定的抗氧化活性和低弱的抗凝血活性。本研究将借助化学和仪器方法,分析虾夷扇贝内脏中多糖的种类和结构特征,为开发利用这一生物资源提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis) 由大连獐子岛渔业集团股份有限公司提供。将新鲜虾夷扇贝内脏取出,冷冻干燥,粉碎,过20目筛,得扇贝内脏粉,储藏于-20℃冰箱中备用。胰蛋白酶(250N.F. U/mg)、木瓜蛋白酶(3500U/mg)、肝素、透明质酸 购自生工生物工程(上海)股份有限公司;木糖、D-葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、硫酸软骨素、D(+)-氨基半乳糖盐酸盐、D-核糖 购自Sigma;岩藻糖、D-氨基葡萄糖盐酸盐、鼠李糖 购自Fluka;D-半乳糖 购自BIO BASIC INC;PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 购自国药集团有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

UV-2100型紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司;液相色谱线性离子阱质谱仪 德国赛默飞世尔科技公司;傅里叶变换红外光谱仪 美国铂金埃尔默仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SVP的制备 虾夷扇贝内脏粉加入25倍水,用6mol/L的NaOH调pH至8.0,温度37℃,加入2.0%的胰蛋白酶,水解4h后,升温至50℃,再加入2.0%木瓜蛋白酶,水解4h后,升温至100℃灭酶10min,冷却至室温后,调至中性,离心10min(4000r/min),取上清液加3倍体积95%乙醇,醇沉12h,离心10min(4000r/min),取沉淀,冷冻干燥得扇贝内脏粗多糖。将扇贝内脏粗多糖配成质量分数为5%的水溶液,用NaOH调节至pH为9,然后加七分之一体积的30%H2O2,在60℃水浴条件下加热2h,取出冷却至室温,加3倍体积无水乙醇,醇沉12h,离心,取沉淀,冷冻干燥后得到SVP,得率1.11%。

1.2.2 SVP的组成分析 蛋白质含量采用福林酚法测定[4],中性糖含量采用苯酚硫酸法测定[5],硫酸根含量采用明胶-比浊法测定[6],硫酸多糖含量以硫酸软骨素为对照品采用1,9二甲基亚甲蓝光度法测定[7]。

1.2.3 红外光谱分析 将样品分别与KBr以1∶100(W/W)比例混合研细后,以KBr为本底,在4000～400cm-1波数范围内扫描红外吸收。

1.2.4 PMP柱前衍生化法分析SVP的组成

1.2.4.1 糖样的制备 称取SVP 4mg,分别溶于1mL 2mol/L的三氟乙酸中,充N2密封,在121℃的条件下水解2h,冷却后旋转蒸发去除三氟乙酸,加水溶解继续旋蒸直至无酸味,得扇贝内脏多糖的单糖水解物。

称取扇贝内脏多糖(SVP)、肝素(HP)、硫酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)、鲍鱼性腺硫酸多糖(AGSP)各4mg,分别溶于1mL 1mol/L的三氟乙酸(TFA)中,充N2密封,在110℃的条件下水解3h,冷却后旋转蒸发去除三氟乙酸,加水溶解继续旋蒸直至无酸味,得到含二糖片断的水解物。

1.2.4.2 PMP衍生物的制备 各种水解物溶于2mL氨水中,混合标准单糖溶于5mL氨水中,分别取混合标准单糖和10种标准单糖溶液100μL与100μL的PMP/甲醇溶液(0.3mol/L)混合,分别取SVP水解物200μL与200μL的PMP/甲醇溶液(0.3mol/L)混合,将所有混合液均放置在70℃下反应30min。取出后冷却至室温,加入1.5mL纯水,旋转蒸发去除氨水,重复2次。干燥后的物质用1mL纯水及1mL氯仿溶解,充分振荡后除去有机相,重复3次,静置,取上清液过0.22μm水相膜,用于HPLC-PAD-MS分析。

标准单糖甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、氨基葡萄糖(GlcN)、氨基半乳糖(GalN)、核糖(Rib)、阿拉伯糖(Ara)(各10mg),也按照上述操作进行衍生化,作为对照品使用。按照摩尔比为0.1mmol准确称取各单糖(不含Ara)作为单糖混合对照品,按照上述操作进行衍生化。

1.2.4.3 HPLC-PAD-MS分析 仪器:配备电喷雾离子源(ESI)和光电二极管阵列检测器(PDA)的LXQ线性离子阱质谱仪,XCalibur软件操作系统。

色谱条件:Silgreen ODS C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱;柱温30℃;流动相20mmol乙酸铵-乙腈(78∶22,V/V);流速1mL/min。

质谱条件:离子源ESI源;喷雾电压4.5kV;毛细管温度为275℃;毛细管电压为37V;鞘气:40AU;辅助气:10AU;正离子模式检测;扫描方式为全扫描(Full Scan);扫描范围为100～2000(m/z)。

2 结果与讨论

2.1 SVP组分分析结果

SVP蛋白质含量为4.09%,表明已经基本去除了蛋白质。中性糖含量较高,为75.37%。硫酸根含量为0.63%,硫酸多糖含量为8.77%。

2.2 SVP红外光谱分析结果

SVP的红外光谱如图1所示,显示了多糖的吸收特征。在3422cm-1处有强且宽的吸收峰,系多糖上的O-H的伸缩振动;2935cm-1附近的肩峰为饱和C-H伸缩振动的信号;1655cm-1处较强吸收,可能是C=O键的伸缩振动,或是酰胺键中N-H键的变角振动;1040cm-1处强吸收为C-O伸缩振动;1413cm-1处的吸收峰为硫酸基的特征吸收;而1250cm-1吸收峰可归属为-OSO3基团的S=O伸缩振动。

图1 SVP红外光谱Fig.1 IR spectrum of SVP

2.3 SVP单糖组成测定结果

图2 SVP单糖PMP衍生物液相色谱图。Fig.2 Chromatograms of PMP-labeled monosaccharides in SVP.注:图A为紫外检测器(245nm)色谱图,图B、C、D、E、F分别为提取m/z 510.23,511.21,481.20,495.22,525.19离子的色谱图。

与薄层色谱法和气相色谱法相比,PMP柱前衍生化液相色谱法分析复杂多糖单糖组成更为有效[8]。但是,使用HPLC-UV分析时,常常会发生不同单糖PMP衍生物保留时间近似而难以区分的现象,另外,杂质峰也会干扰指认。本研究以HPLC-PAD-MS对单糖的PMP衍生物进行检测,利用PAD和MS的定性作用,对色谱峰进行定性辨别。在质谱中,由于不同类型单糖的分子量不同,生成的PMP衍生物的准分子离子峰质荷比不同。氨基己糖(如GlcN和GalN)、己糖(如Man、Glc和Gal)、戊糖(如Ara,Rib和Xyl)、甲基戊糖(如Rha和Fuc)、己糖醛酸(如GlcA和GalA)PMP衍生物准分子离子峰的理论质荷比分别为510.23、511.21、481.20、495.22和525.19。

本实验是通过与标准单糖保留时间、紫外光谱、质谱信息进行对比,指认各色谱峰。如图2所示,采用选择离子方式,可以依据分子量差别分别显示各类型单糖。但需要说明的是,该方法仍不能区分保留时间相同的同分异构体,Ara和Xyl,而据文献报道它们均大量存在于虾夷扇贝内脏多糖中[2,9]。最终,判断SVP中的主要组成单糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外还含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc。其中,GlcN,GalN,GalA由于含量较少,在紫外色谱图中难以分辨(图2A),而质谱技术提高了灵敏度(图B和F)实现了检出。这三种单糖常见于糖胺聚糖中,它们的存在提示扇贝内脏可能存在糖胺聚糖,而糖胺聚糖的种类还需下步实验分析。

2.4 SVP种类的分析结果

在酸水解中,糖醛酸的糖苷键是最难断裂的,因此,在较弱的酸水解条件下,可以产生非还原端为糖醛酸的二糖片段。本研究是通过鉴定多糖水解产生的二糖片段,间接推断含糖醛酸多糖的种类。该方法未见文献报道。通过对SVP水解物的PMP-HPLC-PAD-MS分析,发现了四种二糖片段,它们的PMP衍生物分子离子峰质荷比有两种,m/z 686和m/z 687。

由分子离子峰m/z 686推测该二糖为糖醛酸与氨基己糖连接而成。而广泛存在于扇贝组织中的糖胺聚糖[10-12]就是由糖醛酸与氨基己糖组成,包括肝素(HP),硫酸软骨素(CS)和透明质酸(HA)等。经过酸水解,肝素将生成IdoA-(1→4)-GlcN,硫酸软骨素将生成GlcA-(1→3)-GalN,透明质酸将生成GlcA-(1→3)-GlcN,它们PMP衍生物的分子离子峰理论均为m/z 686.3。如图3所示,选择离子m/z 686.3得到的色谱图中,SVP的二糖PMP衍生物的保留时间与硫酸软骨素的一致,说明扇贝内脏中可能存在硫酸软骨素或其它可水解得该二糖片段的多糖。该二糖及其PMP衍生物结构如图4所示。

图3 SVP(A),HP(B),CS(C)以及HA(D)降解物中二糖PMP衍生物的选择离子m/z 686.3色谱图Fig.3 Chromatograms of PMP-labeled disaccharides in SVP(A),HP(B),CS(C)and HA(D) with extracted ion at m/z 686.3

图4 GlcA-(1→3)-GalN及其PMP衍生物的结构Fig.4 Structures of GlcA-(1→3)-GalN and its PMP derivative

由分子离子峰m/z 687推测该二糖为糖醛酸与己糖连接而成。如图5A所示,选择离子m/z 687.3获得的色谱图中可见三个色谱峰,说明扇贝内脏中存在三种由糖醛酸与己糖重复二糖片段构成的多糖。目前,对这种类型多糖的研究开发还较少,缺少商品化的标准品。本课题组前期从鲍鱼性腺中分离得到的多糖(AGSP)主链结构由GlcA-Man重复二糖片段构成,酸水解可产生GlcA-(1→2)-Man,该二糖及其PMP衍生物结构如图6所示[13]。如图5B所示,AGSP的二糖PMP衍生物的色谱峰对比,推测扇贝内脏中存在AGSP或其它可水解得该二糖片段的多糖。

图5 SVP(A)和AGSP(B)二糖衍生物选择离子色谱图。其中,提取的离子质荷比为687.3Fig.5 Chromatograms of PMP-labeled oligosaccharides with extracted ions at m/z 687.3 in SVP(A)and AGSP(B)

图6 GlcA-(1→2)-Man 及其PMP衍生物的结构Fig.6 Structures of GlcA-(1→2)-Man and its PMP derivative

3 结论

SVP中蛋白质含量为4.09%,中性糖含量为75.37%,硫酸根含量为0.63%,硫酸多糖含量为8.77%,红外光谱中具有多糖特征吸收峰。采用PMP-HPLC-PDA-MS分析SVP的单糖组成,SVP中的主要组成单糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外还含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc。通过HPLC-PDA-MS对酸降解产物中二糖的分析,推测扇贝内脏中存在硫酸软骨素或其类似物、AGSP或其类似物以及另外两种结构中存在糖醛酸与己糖重复二糖片段的多糖,首次实现了对虾夷扇贝内脏中多糖种类的鉴定。该方法是通过鉴定多糖酸水解产生的二糖片段来推断含糖醛酸多糖的种类,避免了繁琐的分离纯化过程,使用样品量较少,可在较短时间内可获得结果。这种鉴别多糖的方法未见文献报道。本研究较为全面深入的提供了扇贝内脏中多糖的信息,为开发利用扇贝内脏提供了基础的研究数据。

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Composition analysis of polysaccharides from viscus ofPatinopectenyessoensisby PMP-HPLC-MS

HUANG Lu,WANG Hong-xu,YIN Ting,CAO Jiu-ling,WEN Cheng-rong,SONG Shuang*

(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,National Engineering Research Center of Seafood,Dalian 116034,China)

Polysaccharides were prepared from viscus ofPatinopectenyessoensis,and the contents of neutral sugar,protein,sulfate,sulfated polysaccharides were determined as 75.37%,4.09%,0.63% and 8.77%,respectively,by chemical methods. IR spectrum showed characteristic absorption of polysaccharides. Acid hydrolysates of the polysaccharides fromPatinopectenyessoensisviscus were analyzed by PMP-HPLC-PDA-MS. The results indicated that Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc and Ara were the main components,whereas others,e.g. GlcN,GalN,GalA and Glc,were in a minor content. In addition,chondroitin sulfate or its analogue as well as three polysaccharides composed of a hexose and a hexuronic acid were found by analyzing the resulting disaccharides. This research provided information of polysaccharides in the scallop viscus,and helped to exploit and re-utilize this processing by-product.

Patinopectenyessoensis;viscus;polysaccharide;PMP-HPLC-MS

2014-11-05

黄璐(1989-)，女，在读硕士研究生，研究方向：海洋食品生理活性物质。

*通讯作者:宋爽(1981-),女，博士，讲师，研究方向：海洋天然产物研究。

国家自然科学基金(31301431)；辽宁省教育厅一般项目(L2014222)；辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划(2014002)；国家火炬计划(2012GH560223)；国家高技术发展计划(863计划)课题(2014AA093602)。

TS254.9

A

1002-0306(2015)07-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.015