低氧通气处理马铃薯富集γ-氨基丁酸的培养条件优化

白青云,陈迁迁,严煌倩,吴 佑,赵 立,毕艳红

(淮阴工学院生命科学与化学工程学院,江苏淮安 223003)

低氧通气处理马铃薯富集γ-氨基丁酸的培养条件优化

白青云,陈迁迁,严煌倩,吴 佑,赵 立,毕艳红

(淮阴工学院生命科学与化学工程学院,江苏淮安 223003)

采用低氧通气的方法,对马铃薯富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的培养工艺和培养液组分进行研究。首先通过正交实验优化了马铃薯富集GABA的工艺,接着采用Box-Behnken设计对影响马铃薯GABA富集的培养液组分进行了优化。结果表明,低氧通气富集马铃薯中GABA的最佳工艺为培养时间4h、培养温度20℃、培养液pH5.8。极差分析表明,培养液pH是最主要的影响因素,培养温度次之,最后是培养时间。在最适培养工艺下,马铃薯中GABA的富集量为0.3160mg/g,是原料中GABA含量的3.45倍;Box-Behnken设计优化的最优培养液组分为谷氨酸钠(MSG)浓度15.43mg/mL、CaCl2浓度2.81mmol/L和VB6浓度0.03mg/mL,在此条件下马铃薯中GABA含量为0.5749mg/g,是原料的6.28倍,说明优化后的培养液组分能显著提高马铃薯中GABA含量。方差分析表明,所建的回归模型显著,能很好地预测马铃薯中GABA含量的变化。

马铃薯,γ-氨基丁酸,富集,低氧通气,培养条件

马铃薯(SolanumtuberosumL)是茄科茄属一年生草本,又名土豆、山药、洋芋、洋番薯等,营养价值十分丰富,具有多种食疗保健作用[1]。我国是马铃薯生产大国,居世界前列。马铃薯块茎是重要的粮食、蔬菜兼用作物,近二十年来,国内外对马铃薯的开发利用以加工马铃薯食品和开发马铃薯淀粉为主,而对马铃薯中蛋白质研究较少。马铃薯块茎中蛋白质的含量为2.0%,若以干物质计算,则为9.8%,与小麦含量相当,高于普通玉米和稻米;其氨基酸含量和比例符合人体的需要,非蛋白氮以游离氨基酸和酞胺酸为主,块茎所含游离氨基酸不少于20种,游离氨基酸和酞胺酸提高了块茎的营养价值[2]。

马铃薯收获后仍是一个活的有机体,在贮藏过程中不断进行新陈代谢等生物化学变化[3]。研究表明,利用谷物及茶叶、果蔬中自身存在的谷氨酸脱羧酶,可富集对人体具有保健作用的γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)[4]。GABA是生物体内广泛存在的一种非蛋白质氨基酸,由谷氨酸(Glu)经谷氨酸脱羧酶(GAD EC 4.1.1.15)脱羧产生,是哺乳动物大脑抑制性神经递质。GABA具有降血压、利尿、镇静神经、改善失眠以及肾肝功能活化等作用[5]。植物组织中GABA含量很低,不能满足人体需要。报道称,植物受到低氧、冷激、热激、干旱、盐胁迫和机械伤害等逆境胁迫时体内GABA含量明显升高[6]。目前,关于食物富集GABA的方法屡见报道,如茶叶采用厌氧处理富集GABA[7]、麦胚采用水浴保温富集GABA[8]等。低氧通气是植物非生物胁迫的重要手段之一,其在食品加工中的使用也是安全可靠的。利用生物技术激活植物内源酶富集GABA,开发具有保健功能的食品,不但有利于提高产品的附加值,更有利于消费者健康。

本实验选用种植面广、粮蔬兼用的马铃薯为原料,采用低氧通气方法研究马铃薯富集GABA的关键技术,优化技术参数,为开发富含GABA的马铃薯食品提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯 市售新鲜原料,购买后贮藏于0～4℃密封环境中,备用;GABA标品 购自美国Sigma化学品公司;其他试剂 购自国药化学试剂有限公司,均为分析纯。

TDL-40B型离心机 上海安亭仪器厂;HH-6型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;UV-2802型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;FK-A组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市环宇科学仪器厂;SB-980型增氧泵 浙江森森实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 低氧通气富集马铃薯中GABA的方法 称取20g左右的新鲜去皮马铃薯块茎,置于500mL烧杯中,按料液比1∶25加入培养液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液),然后在培养液中通入空气,通气量由两个通气头控制,于一定温度下通气处理一定时间,培养结束后取出样品,测定其GABA含量。

1.2.2 培养工艺对马铃薯富集GABA的影响 对影响马铃薯富集GABA的培养工艺,先进行单因素实验,设定培养温度为20～60℃,培养时间为2～10h,缓冲液pH为4.6～6.4,在单因素实验的基础上,采用正交实验设计原理的三因素三水平实验设计,优化马铃薯富集GABA的最适培养工艺。实验因素水平表见表1。

1.2.3 培养液组分对马铃薯富集GABA的影响 为进一步提高马铃薯中GABA含量,在最适培养工艺的基础上,对影响GABA富集的外源添加物谷氨酸钠(MSG)、维生素B6(VB6)和CaCl2的最适浓度进行研究。分别配制不同浓度的各组分溶液,所有溶液均由10mmol/L的柠檬酸缓冲液配制而成,调节初始pH至5.8,MSG浓度设为6、10、14、18mg/mL;VB6浓度设为0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL;CaCl2浓度设为1.0、2.0、3.0、4.0mmol/L。

表1 马铃薯富集GABA的培养工艺因素水平表

对影响马铃薯GABA富集的培养液组分采用Box-Behnken design实验设计进行优化,以GABA含量作为考察值,实验因素水平表见表2。

表2 马铃薯富集GABA的培养液组分Box-Behnken实验设计因素水平表

1.3 GABA测定方法

将富集GABA后的马铃薯样品用组织捣碎机磨碎后,精确称取1g左右样品于20mL离心管中,加入6mL 7%的乙酸提取1h后于4000r/min离心10min,上清液中再加入4mL无水乙醇沉淀30min,4000r/min离心10min后,上清液经旋转蒸发浓缩至干,用1mL蒸馏水溶解后于10000r/min离心10min,上清液用于测定GABA含量。GABA含量测定参照杨胜远等[9]的方法,采用比色法测定。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 培养工艺对马铃薯中GABA含量的影响

2.1.1 培养温度对马铃薯富集GABA的影响 由图1可见,在20～60℃范围内,马铃薯低氧通气处理4h的条件下(培养液pH5.8),温度对马铃薯中GABA含量有显著影响,呈先上升后下降的趋势,30℃时GABA含量与40℃无显著差异,均最高,分别为20℃和60℃的1.15和1.48倍。发芽粟谷随培养温度升高GABA得到积累[10],麦胚富集GABA的最适温度为46℃[8]。本研究中,温度过高马铃薯中GABA含量下降、淀粉析出、马铃薯易熟化,因此,马铃薯中增加GABA含量的适宜培养温度为30℃。

2.1.2 培养时间对马铃薯GABA含量的影响 在温度30℃、培养液pH5.8的条件下,马铃薯中GABA含量随培养时间的延长而变化的情况见图2。从图2可以看出,随着培养时间的延长,马铃薯中GABA含量呈先急速增加而后缓慢降低的趋势,培养8h含量最高,是培养2h的2.76倍;培养6h马铃薯中GABA含量与培养8h无显著差异(p<0.05)。浸泡时间长,马铃薯淀粉析出,因此,选择培养6h为马铃薯富集GABA的适宜时间。

图2 培养时间对马铃薯中GABA含量的影响Fig.2 Effect of culture time on GABA content of potato

2.1.3 培养液pH对马铃薯中GABA含量的影响 在培养温度30℃、培养时间4h的条件下,培养液pH对马铃薯中GABA富集的影响结果见图3。pH在4.6～6.4之间,GABA含量随pH的升高先升高后下降。当pH为5.2时,GABA含量最高,分别比pH4.6和6.4时含量提高41.03%和32.45%。酸性环境下有利于植物GABA的富集[11],因此,马铃薯富集GABA的适合pH为5.2。

图3 培养液pH对马铃薯中GABA含量的影响Fig.3 Effect of culture solution pH on GABA content of potato

2.1.4 正交实验法优化马铃薯富集GABA的培养条件 在单因素实验的基础上,以培养时间(A)、培养温度(B)和培养液pH(C)三因素进行正交实验,优化马铃薯富集GABA的最适培养工艺,实验结果见表3。

正交实验数据表明,马铃薯富集GABA的最适培养条件为A1B1C3,即培养时间4h、培养温度20℃、培养液pH5.8。极差分析可知,培养液pH是最主要的影响因素,培养温度次之,最后是培养时间。在最适培养工艺下,马铃薯中GABA含量为0.3160mg/g,是原料的3.45倍。

表3 马铃薯富集GABA的培养工艺正交实验结果

2.2 外源添加物对马铃薯富集GABA的影响

2.2.1 MSG对马铃薯中GABA含量的影响 由图4可知,随着培养液中MSG浓度的增加,马铃薯中GABA含量呈先增长后下降的趋势。当MSG浓度为14mg/mL时,GABA含量最高,比对照(最优培养工艺下)提高14.84%。MSG作为植物GAD的专一底物,可以促进GABA的合成[11]。张磊研究表明,米糠中添加MSG可以促进GABA的富集[12],本研究结果与其一致。

图4 MSG浓度对马铃薯GABA含量的影响Fig.4 Effect of MSG concentration on GABA content in potato

2.2.2 CaCl2对马铃薯中GABA含量的影响 CaCl2对马铃薯中GABA富集的影响见图5。随着CaCl2浓度的增加,马铃薯GABA含量呈先增长后下降的变化趋势。当CaCl2浓度为2.0mmol/L时,GABA富集量最大,此时GABA含量为0.3627mg/g,是对照的1.15倍。植物GAD受Ca2+的调节,增加的Ca2+刺激GAD活性,促进GABA的积累[13]。低氧胁迫下发芽粟谷中GABA含量由于Ca2+浓度的增加显著提高[10]。

图5 CaCl2浓度对马铃薯GABA含量的影响Fig.5 Effect of CaCl2 concentration on GABA content in potato

2.2.3 VB6对马铃薯中GABA含量的影响 培养液中添加VB6显著促进了马铃薯中GABA的含量增加(图6)。GABA含量随VB6添加量的增加而提高,当VB6为0.03mg/mL时,GABA含量最高,是添加0.01mg/mL VB6的1.27倍。研究表明,VB6是GAD的辅基磷酸吡哆醛(PLP)的前体物质,有激活GAD达到富集GABA的作用[14]。

图6 VB6浓度对马铃薯GABA含量的影响Fig.6 Effect of VB6 concentration on GABA content in potato

2.2.4 马铃薯富集GABA的培养液组分优化 在单因素实验的基础上,选用三因素三水平的Box-Behnken实验设计对马铃薯富集GABA的培养液组分MSG浓度(X1)、CaCl2浓度(X2)和VB6浓度(X3)进行优化,实验方案和相应的实验结果见表4。

利用Design Expert软件,对表4数据进行二次多元逐步回归拟合,得到马铃薯富集GABA预测值的二次多项逐步回归方程:

Y=-0.3173+0.0735X1+0.0405X2+13.2038X3+0.0706 X1X3+1.3975X2X3-0.0107X22-250.3750X32

表4 马铃薯富集GABA的培养液组分Box-Behnken实验设计和结果

对上述回归模型进行方差分析(表5),结果表明,回归模型的F=19.99,p=0.0003,模型显著,其决定系数R2=0.9625,说明此模型相关性良好,模型具有实践指导意义。

根据回归法分析所得二次方程,在实验设定范围内,分析任意两变量之间的交互作用对响应值的影响,得到二次回归方程的响应曲面图,见图7、图8。

图7 MSG和CaCl2的交互作用对马铃薯GABA含量影响的响应曲面图Fig.7 Response plots for the interaction effects of MSG and CaCl2 on GABA content of potato

表5 回归模型方差分析

图8 CaCl2和VB6交互作用对马铃薯GABA含量影响的响应曲面图Fig.8 Response plots for the interaction effect of CaCl2 and VB6 on GABA content of potato

当VB6浓度为0.03mg/mL时,MSG和CaCl2对马铃薯中GABA富集的影响见图7。MSG的一次项和二次项对马铃薯GABA含量有极显著的影响(p<0.01),CaCl2的一次项对马铃薯GABA含量有显著影响,两者的交互作用影响显著(p<0.05)(表5)。在固定的MSG浓度下,GABA含量随CaCl2浓度的增加呈先逐渐增加随后缓慢下降的趋势。当CaCl2浓度为2.81mmol/L时,GABA富集量最大。当MSG浓度为15.43mg/mL,GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物,添加适量的MSG可以促进GABA 合成,形成有效积累[11]。Ca2+是GAD的激活剂,通过与GAD碳末端的Ca2+/CaM调节区域结合而激活其活性[13],促进GABA 富集。研究报道,MSG与CaCl2的联合处理可促进米糠GABA含量的提高[12],本研究结果与此报道结果一致。

当MSG浓度为14mg/mL时,CaCl2和VB6浓度对马铃薯中GABA含量的影响见图8。VB6的一次项和二次项对马铃薯GABA含量有极显著的影响(p<0.01),两者的交互作用对GABA含量的影响也显著(p=0.0321)(表5)。当VB6浓度在0.02～0.03mg/mL时,GABA含量呈上升趋势,超过0.03mg/mL,GABA含量下降。研究表明,一定浓度的VB6处理促进了米糠[12]、米胚[15]和豇豆[16]中GABA的积累量。本研究发现,VB6处理有利提高马铃薯中GABA含量。

根据Box-Behnken实验结果,马铃薯富集GABA的最佳培养液组分浓度分别为MSG浓度15.43mg/mL、CaCl2浓度2.81mmol/L和VB6浓度0.03mg/mL,在此条件下马铃薯富集GABA的预测值为0.6014mg/g,验证实验得出实测值为0.5749mg/g,说明预测值和实际值之间存在较高的拟合度,所建立的模型是可靠的,可以用来描述组分浓度与响应值之间的关系。以最适浓度培养液培养的马铃薯GABA含量是对照(未添加各组分,0.3160mg/g)的1.81倍,是原料(0.0916mg/g)的6.28倍,说明优化后的培养液能显著提高马铃薯中GABA含量。

3 结论

采用正交实验设计优化了马铃薯富集GABA的培养工艺,结果表明,培养液pH、培养温度和培养时间对马铃薯GABA富集有显著影响,三因素的影响顺序依次为培养液pH>培养温度>培养时间,最佳的培养工艺为培养时间4h,培养温度20℃,培养液pH5.8,此时马铃薯中GABA的富集量为0.3160mg/g,是原料的3.45倍。采用响应面的Box-Benhnken法对马铃薯富集GABA的培养液组分浓度进行优化,马铃薯GABA富集的最佳培养液组分是MSG浓度15.43mg/mL、CaCl2浓度2.81mmol/L和VB6浓度0.03mg/mL,在此条件下马铃薯中GABA含量为0.5749mg/g,是原料的6.28倍。方差分析可知,CaCl2、MSG、VB6浓度对马铃薯中GABA的富集均有显著影响,MSG和CaCl2、CaCl2和VB6的交互作用均对马铃薯中GABA富集有显著影响。

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Optimization of culture conditions for γ-aminobutyric acid accumulation in potato using hypoxia aerating

BAI Qing-yun,CHEN Qian-qian,YAN Huang-qian,WU You,ZHAO Li,BI Yan-hong

(School of Life Science and Chemical Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai’an 223003,China)

The culture processes and culture solution components of γ-aminobutyric acid(GABA)accumulation in potato using hypoxia aerating method were researched in this paper. Firstly,the culture processes of GABA accumulation in potato was optimized using orthogonal experimental design. Subsequently,the optimal culture solution components on GABA accumulation of potato were investigated using Box-Behnken design. The results showed that the optimum culture processes of GABA accumulation in potato under hypoxia aerating were culture time 4h,temperature 20℃,and pH of culture solutions 5.8. Range analysis indicated that pH of culture solutions was the most important influence factor,followed by culture temperature,and culture time was the last. Under these conditions,the accumulation of GABA in potato was 0.3160mg/g,which was 3.45 times of material. Box-Behnken experimental design results displayed the optimum compositions of culture solution were MSG concentration 15.43mg/mL,CaCl2concentration 2.81mmol/L,and VB6concentration 0.03mg/mL. Under these conditions,the highest GABA content of potato was 0.5749mg/g,6.28-fold of material. It indicated that the optimized culture solution compositions significantly increased GABA content of potato. Analysis of variance indicated that the regression model was significant,could forecast the changes of GABA accumulation in potato excellently.

potato;γ-aminobutyric acid;accumulation;hypoxia aerating;culture conditions

2014-08-05

白青云(1973-),女,博士,副教授,研究方向:农产品加工与贮藏。

江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目(2013)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)07-0241-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.043