罗格列酮对前列腺癌细胞血管生成拟态的影响

秦亮 陈安民 郭风劲 杨卿 任晔 徐飞 廖晖

·实验研究论著·

罗格列酮对前列腺癌细胞血管生成拟态的影响

秦亮 陈安民 郭风劲 杨卿 任晔 徐飞 廖晖

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)配体罗格列酮(rosiglitazone，RGZ)对前列腺癌PC-3细胞血管生成拟态的影响。方法 体外培养人前列腺癌PC-3细胞，应用细胞增殖与毒性检测(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法观察罗格列酮不同浓度和不同作用时间对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响；体外建立matrigel三维培养系统，观察罗格列酮对PC-3细胞血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM) 形成的影响；应用RT-qPCR和ELISA的方法检测血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)、EphA2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA和 VEGF蛋白的表达。结果 罗格列酮在48 h后明显抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。前列腺癌PC-3细胞在体外三维培养条件下能够形成环状和网络样结构。罗格列酮能够抑制PC-3细胞VEGF、VE-cadherin、EphA2 mRNA及VEGF蛋白的表达，并使其形成血管生成拟态的能力明显降低。结论 罗格列酮可能通过下调前列腺癌细胞VEGF、VE-cadherin、EphA2的表达抑制血管生成拟态形成。

前列腺肿瘤；过氧化物酶体增殖物激活受体；罗格列酮；血管生成拟态

近年来由于我国人口老龄化及生活习惯的改变，前列腺癌在我国男性泌尿生殖系统肿瘤的发病率中已跃升至第三位[1]。血液供应在前列腺癌的发生和转移等环节起到了重要作用。在肿瘤中，除了传统的血管生成外，还有许多没有内皮细胞附着的管腔、窦腔存在，这些管腔是由肿瘤细胞围成的，并且存在过碘酸Schiff(periodic acid-Schiff，PAS)染色阳性的基底膜。这种被称为血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)的机制可能是一种不同于经典的肿瘤细胞(特别是肿瘤中没有血管化区域)获得营养而生长的肿瘤血管生成途径[2]。多种原代肿瘤切片中已经被证实存在这种结构，并且与不良预后、高转移潜能强相关[3-5]。

过氧化物酶体增殖体激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)属于核激素受体超家族的成员。PPARγ是噻唑烷二酮类(TZDs)药物的分子靶点，后者是一类胰岛素增敏剂，包括曲格列酮(TGZ)、环格列酮(CGZ)、罗格列酮(RGZ)、吡格列酮(PGZ)。PPARγ在多种生理病理过程中发挥重要作用，例如：促进脂肪细胞分化，激活胰岛素，调节脂质代谢，抑制肿瘤细胞增殖及对炎症过程的多种影响[6]。除了代谢方面的机制外，PPARγ激动剂显示了多种抗肿瘤作用,抑制肿瘤细胞生长和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，并且促进肿瘤细胞分化，在体内模型中抑制自发性转移[7，8]。

鉴于TZDs可以调节多种基因的表达，包括肿瘤细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其受体，而VEGF(又称VEGF-A)是血管生成拟态的重要效应分子，是重要的促血管生成因子之一，对内皮细胞生长的生理调节发挥重要作用。作者于2011年1月至2012年1月对PPARγ激动剂罗格列酮(rosiglitazone，RGZ)在前列腺癌血管生成拟态形成中的作用进行了研究，并进一步探讨其可能机制。

材料与方法

一、材料

人前列腺癌细胞株PC-3购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，RPMI1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自Gibco公司，胰蛋白酶和罗格列酮购自Sigma公司，CCK-8试剂盒购自北京碧云天公司，基质胶Matrigel购自BD公司，TRIzol及逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，RT-qPCR试剂盒购自Toyobo公司，PCR引物由Invitrogen合成，人VEGF ELISA试剂盒及DMSO购自武汉博士德公司。

二、方法

(一)细胞培养

1. 二维细胞培养 将前列腺癌细胞株PC-3细胞置于37 ℃、5%CO2恒温细胞培养箱内培养，2～3 d更换培养基，取对数生长期细胞进行三维培养及其他实验。

2. 基质胶Matrigel三维培养 参考El Hallani等[9]的方法，6孔培养板中每孔放入1张经消毒的18 mm×18 mm盖玻片。在每张盖玻片的中央均匀滴加50 μl matrigel原液，37 ℃培养箱内凝固30 min；胰酶消化重悬前列腺癌PC-3细胞后制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数调节细胞密度为1×105个/ml，每孔在凝胶表面接种2 ml细胞，罗格列酮实验组分别调整浓度为0.1% DMSO或0.1、1.0、10.0 μmol/L(由于噻唑烷二酮类药物浓度>10.0 μmol/L时会激活PPARα和PPARδ受体[10]，所以本实验使用<10.0 μmol/L浓度)，37 ℃培养箱培养，48 h后倒置显微镜观察，拍照(×100)，每孔拍摄3个随机视野，对形成的环状结构进行手工计数，以细胞间形成的1个完整管腔为1个计数单位，取平均值进行统计分析。

(二)CCK-8实验

取对数生长期前列腺癌细胞株PC-3制成单细胞悬液，以1×104个/孔接种于96孔培养板,在常规培养液中培养24 h(5%CO2、37 ℃)加入含0.1%DMSO或不同浓度罗格列酮(0.1、1.0、10.0 μmol/L)的培养液100 μl。分别培养1～6 d，加入10 μl CCK-8试剂，避光37 ℃孵育60 min后，于酶联免疫检测仪上选择450 nm波长。测定各孔A450值，每组重复3孔。

(三)RT-qPCR检测血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)，EphA2、VEGF mRNA表达

前列腺癌PC-3细胞常规培养，取对数生长期前列腺癌PC-3细胞，细胞计数后转入6孔板。分0.1% DMSO对照组和罗格列酮刺激组(0.1、1.0、10.0 μmol/L)干预细胞48 h后以TRIzol抽提不同实验组总RNA，取1 μg mRNA为模板并按照逆转录试剂盒说明书用随机引物合成第一链cDNA，然后以cDNA为模板进行荧光实时定量PCR检测。

引物如下：VEGF上游引物为5′-AGGGCAG-AATCATCACGAAGT-3′，下游引物为5′-GCTGCGCTGATAGACATCCA-3′，扩增产物为52 bp；EphA2上游引物为5′-TGGCTCACACACCCGTATG-3′，下游引物为5′-CATGTAGATCGGCATGTCATTCA-3′，扩增产物为72 bp；VE-cadherin上游引物为5′-TTGGAACCAGATGCACATTGAT-3′，下游引物为5′-TCTTGCGACTCACGCTTGAC-3′，扩增产物为86 bp。内参GAPDH上游引物为5′-CCATGAGAAGTATGACAACAGCC-3′，下游引物为5′-GGGTGCTAAGCAGTTGGTG-3′，扩增产物70 bp。

反应按照Toboyo RT-qPCR检测试剂盒说明书，在BIO-RAD实时定量PCR仪上完成，且应用GAPDH作为内参进行归一化。反应完成后，目的基因的相对表达量由2-ΔΔCT计算得到，其中ΔΔCT=ΔCT实验组-ΔCT对照组。

(四)ELISA法检测PC-3细胞培养上清中VEGF表达

前列腺癌PC-3细胞常规培养，取对数生长期前列腺癌PC-3细胞，细胞计数后转入24孔板，贴壁生长24 h后，分别按0.1%DMSO对照组和罗格列酮刺激组(0.1、1.0、10.0 μmol/L)浓度更换等量无血清培养基进行培养。培养48 h后，离心取上清，ELISA法检测VEGF含量，按试剂说明书进行检测。每组重复3次。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料及计数资料间的两两比较分别采用t检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、罗格列酮体外抑制PC-3细胞增殖

使用罗格列酮0.1、1.0、10.0 μmol/L及0.1% DMSO处理对数生长期的前列腺癌PC-3细胞1～6 d，前2天CCK-8比色法显示，各组A450值差异无统计学意义(P>0.05)。自第3天开始，加药组细胞分别较对照组增殖明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

二、前列腺癌细胞可以形成VM，罗格列酮可抑制其VM形成

PC-3细胞接种6 h后，可见细胞贴附在胶表面，彼此间呈镶嵌样生长。12 h以后，部分前列腺癌PC-3细胞伸出细长突起，彼此之间相互连接，形成环状结构。DMSO对照组中，三维培养48 h后可见前列腺癌PC-3细胞形成环状和网络样结构(图2a、b)。而罗格列酮刺激48 h后，前列腺癌PC-3细胞形成环状和网络样结构较对照组明显减少。0.1、1.0 μmol/L组可见前列腺癌PC-3细胞能够形成条索状和长条形，可形成少量环状结构，但数量明显减少(图2c、d)；而10.0 μmol/L组中，前列腺癌PC-3细胞基本不能形成条索状和长条形(图2e)。得到DMSO对照组、0.1、1.0、10.0 μmol/L罗格列酮刺激组环状结构数目分别为(31.33±4.53)个、(19.67±3.15)个、(11.67±0.58)个、(5.33±1.53)个，罗格列酮刺激组分别与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且抑制作用呈明显剂量正相关性。

acbed图2 PC⁃3细胞VM形态学观察及不同浓度罗格列酮对其影响 a：对照组前列腺癌PC⁃3细胞VM形成×100；b：前列腺癌PC⁃3细胞×400；c：0．1μmol/LRGZ组×100；d：1．0μmol/LRGZ组×100；e：10．0μmol/LRGZ组×100

三、罗格列酮抑制VEGF、VE-cadherin和EphA2 mRNA表达

与对照组DMSO处理细胞比较，罗格列酮0.1、1.0、10.0 μmol/L刺激细胞后，VEGF mRNA相对表达水平明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)：(1.00±0.06)vs.(0.59±0.06)vs.(0.39±0.05)vs.(0.29±0.04)。VE-cadherin mRNA和EphA2 mRNA相对表达水平也较对照组明显降低，10.0 μmol/L组对其抑制作用最强，差异均有统计学意义(均P<0.05)，对照组及0.1、1.0、10.0 μmol/L罗格列酮刺激组比值分别为(1.00±0.05)vs.(0.74±0.05)vs.(0.71±0.04)vs.(0.59±0.04)，(1.00±0.05)vs.(0.68±0.05)vs.(0.61±0.04)vs.(0.56±0.04)(图3)。

四、罗格列酮抑制VEGF蛋白表达

与对照组DMSO刺激前列腺癌PC-3细胞比较，罗格列酮刺激细胞48 h后，细胞培养上清VEGF蛋白表达水平明显降低，0.1、1.0和10.0 μmol/L罗格列酮刺激组分别与DMSO对照组比较，抑制率分别达到37.44%、55.64%和63.08%，差异均有统计学意义(均P<0.05，图4)。

讨 论

PPARγ对VEGF的影响尚存在争议。Peeters等[11]报道显示罗格列酮通过PPARγ反应元件与VEGF启动子作用抑制VEGF表达。本实验结果显示，罗格列酮在0.1、1.0、10.0 μmol/L浓度时均可明显抑制前列腺癌PC-3细胞VEGF的表达，其抑制率分别达到37.44%、55.64%和63.08%。另外，Terrasi等[12]得出结论相反的报道称TZDs增加VEGF的表达。这些差异考虑与不同的试验中使用的细胞系不同有关。但是目前尚不清楚这些争论是由哪些特殊机制引起的。

本研究显示，罗格列酮可明显抑制前列腺癌PC-3细胞VM形成，而其同时可以抑制VEGF的分泌，对于罗格列酮是否是通过抑制VEGF的分泌而进一步抑制下游VE-cadherin和EphA2等效应分子从而最终影响VM形成，临床上尚有疑问。目前关于VEGF对恶性肿瘤形成血管生成拟态现象中的作用也存有争议。而有些研究通过siRNA沉默VEGF基因等方法证实了VEGF在黑色素瘤、卵巢癌和骨肉瘤等实体肿瘤血管生成拟态形成过程中起到了重要作用，是VM形成的关键影响因素[4，13，14]。然而郄硕等[15]研究发现有血管生成拟态现象存在的肿瘤组织中VEGF表达不增加，甚至下调。其可能原因是肿瘤组织通过血管生成拟态获得了足够的血供，氧气供应充足，故而VEGF表达降低。Schnegg等[16]报道称使用VEGF抑制剂会增加HIF1α表达及VM的形成。这可能是由于使用VEGF抑制剂后肿瘤组织血供减少，继而肿瘤组织通过自身血管生成拟态的形成增加血供的一种适应性选择。

本实验希望通过对VEGF、VE-cadherin和EphA2等分子的研究了解罗格列酮对前列腺癌血管模拟的影响及相关作用机制。罗格列酮在作用前列腺癌PC-3细胞48 h后明显抑制其增殖。为排除细胞增殖差异对结果的影响，血管生成拟态实验时间选为48 h。结果显示，罗格列酮作用于三维培养的细胞48 h后形成环状或网络状结构明显减少，与血管模拟密切相关的VEGF、VE-cadherin和EphA2等效应分子表达均明显降低，提示罗格列酮可能通过下调VEGF、VE-cadherin、EphA2的表达抑制血管生成拟态形成。为探讨PPARγ配体药物用于肿瘤治疗提供了实验依据。

0.20.4mRNA表达对照组0.00.60.1μmolL/组1.0分组0.8EphA21.2VE-cadherinVEGF1.0μmolL/组10.0μmolL/组*********图3 不同浓度罗格列酮对PC⁃3细胞VEGF、VE⁃cadherin和EphA2mRNA表达的影响 罗格列酮刺激细胞48h后，PC⁃3细胞VEGF、VE⁃cadherin和EphA2mRNA相对表达水平明显降低，差异均有统计学意义(∗P<0．05)

200400VEGF(pgmL)/对照组06000.1μmolL/组分组8001.0μmolL/组10.0μmolL/组***1000图4 不同浓度罗格列酮对PC⁃3细胞VEGF表达的影响 细胞培养上清VEGF蛋白表达水平明显降低，不同罗格列酮刺激组分别与对照组比较，抑制率差异均有统计学意义(∗P<0．05)

目前，针对血管生成拟态分子机制的研究尚有很大争议，其与传统的内皮依赖性血管之间的关系尚不明确，但其在肿瘤血液供应中的重要作用正受到越来越多的重视，而VEGF、VE-cadherin、EphA2及PPARγ等相关基因在血管生成拟态中作用还有待进一步的研究。

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Effect of rosiglitazone on vasculogenic mimicry in prostate cancer cell line PC-3.

QINLiang,CHENAnmin,GUOFengjin,YANGQing,RENYe,XUFei,LIAOHui.

DepartmentofOrthopaedics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

LIAOHui,E-mail:liaohui0001@yahoo.com

Objective To investigate the effect of rosiglitazone (RGZ), the ligand of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), on vasculogenic mimicry in human prostate cancer cell line PC-3invitroand to reveal the related molecular mechanisms. Methods PC-3 cells were culturedinvitro. The effect of RGZ with different concentrations (0.1, 1.0 and 10.0 μmol/L) and different action durations (1 to 6 days) on the growth of PC-3 cells was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. A 3-dimensional cell culture system for PC-3 cells was established to observe vasculogenic mimicry formation. The change of vasculogenic mimicry formation under RGZ treatment was observed. Realtime-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the effect of RGZ on the mRNA expression of VEGF, VE-cadherin, and EphA2, respectively. The expression of VEGF protein was analyzed by ELISA. Results RGZ significantly inhibited the cell proliferation after 48 h in a dose- and time-dependent manner. PC-3 cells could form patterned matrix VM or tubular VM in 3-demintional culture system. RGZ markedly reduced VM density or formed shorter tubular VM in 0.1, 1.0, 10.0 μmol/L groups than in control group. After treatment with RGZ for 48 h, the expression levels of VEGF, VE-cadherin, and EphA2 mRNA were decreased in RST-treated group as compared with control group. Meantime, RGZ inhibited VEGF protein secretion, respectively. Conclusion The results indicated that activation of PPARγ by RGZ can inhibit VM formation in PC-3 cells, which may be through down-regulation of the expression of VEGF, VE-cadherin and EphA2.

Prostatic neoplasms; Peroxisome proliferator-activated receptors; Rosiglitazone; Vasculogenic mimicry

10.3969/j.issn.1674-8573.2015.06.002

教育部新教师基金项目(200804871051)；湖北省卫生厅青年人才基金(QJX2010-5)

430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科

廖晖，E-mail：liaohui0001@yahoo.com

2015-07-21