内皮祖细胞在动脉粥样硬化临床中的应用

云苏日娜 孟根杜希 包玉龙 张冲 哈申图雅 包纳日斯 纳顺达来

[摘要] 内皮祖细胞（EPCs）是一种成血管干细胞，通过刺激诱导能够增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，参与血管内皮细胞的损伤和修复。动脉粥样硬化（AS）是血管内皮损伤和脂质聚集在动脉壁上形成的血管病变。机体可通过动员体内EPCs来修复血管内皮细胞从而达到缓解，治疗AS的目的。EPCs对血管内皮细胞修复的作用近年来被广泛研究，本文就内皮祖细胞对AS治疗中的应用以及其基础研究进行系统的综述。

[关键词] 内皮祖细胞；动脉粥样硬化；内皮细胞修复

[中图分类号] R329.27 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（a）-0165-05

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种参与胚胎时期血管生成的干细胞，具有游走特性，在机体刺激诱导下能够继续增殖分化成为成熟血管内皮细胞的前体细胞，并在出生后，参与血管内皮细胞的损伤和修复[1]。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是最常见、最重要的动脉硬化血管病变之一。其特点是动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小，在动脉内膜上积聚的脂质外观呈黄色粥样。AS是一种渐进的，复杂的，慢性炎性反应过程，其特征在于内皮损伤和脂质聚集在动脉壁上[2]。内皮细胞损伤和凋亡是AS病理发生的早期事件，并可促进粥样硬化病变，形成斑块侵蚀[3]。内皮失去完整性促成早期AS病变。从骨髓衍生的内皮祖细胞可分化为内皮细胞，以取代不正常的内皮细胞，进行内源性修复机制[4]。然而体内EPCs数量有限，随着年龄增长，EPCs功能受损，来源于骨髓的外周血EPCs逐渐减少，修复内皮损伤的能力也下降，粥样斑块更容易形成[5]。近年来，就EPCs在AS中的作用被广泛认知，其在AS的发生、发展过程中起到举足轻重的位置。

1 内皮祖细胞概述

1997年，Asahara等[6]首次从人外周血中分离提取出一种具有CD34+的单核细胞，并可进一步生长成血管腔样形状，取名为内皮祖细胞。并发现在成人血管再生中，血管EPCs起着重要的作用。EPCs从骨髓动员到外周血，附着在缺血部位的血管上，在组织中游走、增值、分化，进而分泌出血管新生物质[7-8]。对小鼠下肢缺血模型和心肌梗死模型进行EPCs移植后，侵入到已有的内皮细胞，促进血管新生，这表明EPCs对成人血管生成起到重要作用[9-10]。EPCs存在于血管芽细胞和成熟内皮细胞间的分化过程中，EPCs的分离纯化方法有很多种，其主要方法有两种，即从新鲜血液中进行流式细胞术和细胞培养法[11-13]。

在流式细胞术中至少用一种未分化标志物和内皮系标志组合起来纯化EPCs。血液干细胞抗原CD34、CD133作为典型的未分化标志物，VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）和CD31作为内皮标志物。EPCs分化后一方面CD34表达减少，CD133表达消失，另一方面KDR、VE-cadherin、Tie2、E-selecin的表达增加。血液干细胞也会表达CD34、CD133、KDR，但分化后对CD133和KDR失去表达。因此，CD133阳性细胞作为未分化的EPCs在广泛的应用于基础研究[14-15]。

在细胞培养中，将外周血来源的单个核细胞贴壁培养于包埋了人纤维连接蛋白的培养皿中，作为EPCs来纯化。培养贴壁细胞后出现Early EPCs与Late EPCs[16]。Early EPCs在培养后3 d左右成簇状增值，但2周后消失。Late EPCs能存活2、3周以上，增值迅速，呈铺路石状细胞层。Early EPCs与LateEPCs均都能吞噬ac-LDL和Ulex lectin结合[17]。分离EPCs的细胞源除外周血，还有骨髓与脐带血来源[18-20]。但是，关于调节EPCs分化的遗传因素和环境因素尚未明确。

2 动脉粥样硬化治疗中EPCs的作用

血管内皮细胞是血液与血管壁间的天然屏障，维持血管正常形态、功能起到至关重要的作用。因为EPCs参与血管内皮动态平衡及细胞修复过程，故影响疾病早期斑块的发生与发展。在生理情况下，血管内皮细胞的完整性依赖于EPCs归巢，内源性动员内皮祖细胞可导致增强再内皮化，改善血管内皮的功能，减少新内膜形成，并降低了AS的形成[21]。EPCs体外培养并移植至体内观察其对内皮细胞的修复作用近年来已被广泛证实，却仍有争议，EPCs在AS发生发展中的作用尚不明确。

2.1 EPCs对血管内皮细胞的修复能力

Aziz等[22]通过将人脐血分离出的EPCs移植到急性心肌梗死（AMI）模型犬心肌内，并进行心电图监测，ST段抬高心肌梗死在EPCs移植1周后便好转，26 d后处死动物，进行病理检查，心肌细胞明显修复好转。证实EPCs可通过体外移植修复自身细胞再生。Tateishi-Yuyama等[23]将骨髓来源的EPCs自体移植于血管慢性闭塞性动脉硬化疾病的患者后，明显减轻了病变肢体的静息性疼痛，步行时间延长，肢体血流明显改善，并避免了截肢，观察24周未发现严重并发症。Rauscher等[24]将没有AS病变的apoE4幼鼠及apoE4老龄小鼠骨髓中分离得到的EPCs移植到存在AS病变的apoE4小鼠中，发现与来自年老小鼠的细胞移植相比，用来自幼鼠的EPCs细胞治疗，可显著减轻病变，说明随着年龄的增加内皮祖细胞的保护性能逐渐丢失，这正是AS多发时期，也证实了随着年龄变化EPCs对AS的抑制作用。He等[25]从兔外周血中提取EPCs，并将其移植至经手术损伤的右颈动脉内，4周后处死动物，并将两侧颈动脉做病理，发现吞噬了DiI标记的EPCs的多个细胞簇在颈总动脉的壁上，这表明移植自体内皮祖细胞增强内皮化和改善内皮功能。

EPCs体外培养并移植至体内观察其对内皮细胞的修复作用近年来已被广泛证实，却仍有争议，EPCs在AS发生发展中的作用尚不明确，Liu等[26]推论，内皮祖细胞在疾病进程的不同时间点动员，其结果可能不一样，不适当地增加EPCs动员可能会加速AS的进程。吴倩倩等[27]推测在粥样硬化斑块形成早期，EPCs促进内皮增殖、抑制凋亡，保持血管内皮细胞稳定，防止粥样斑块发生，即早期EPCs数量增加可预防斑块形成。而在粥样硬化斑块形成晚期阶段，内皮损伤严重，难以完整修复，炎症细胞持续作用于斑块，且EPCs促使血管壁滋养新生血管，新生血管可能破裂导致斑块内出血，转变为不稳定性斑块。目前EPCs在人体进行体外移植的试验研究几乎空白，其临床应用的安全性有待更多的探索研究。

2.2 EPCs的体内动员

内皮祖细胞的动员，即受到某些因素刺激后，内皮祖细胞从骨髓等组织中迁移到外周血的过程。这些因素可以分为抑制动员因素和促动员因素。

2.2.1 抑制动员因素 临床上高血压、高血脂、高血糖、心血管疾病及吸烟、肥胖、老化等易至血管动脉硬化病变的患者的EPCs数量减少且EPCs的血管新生能力降低[28]。即EPCs的数量及功能与血管动脉硬化病变的危险因素呈线性关系。李海清等[29]通过对雌性BALB/C小鼠随机分成卵巢切除组、假手术组和正常组4周后取胫骨和股骨骨髓来源的EPCs进行培养、鉴定。结果显示，卵巢切除组EPCs明显低于假手术组和正常组。黄焕亮等[30]对62例原发性高血压患者测定外周循环EPCs CD34+水平及颈动脉内膜中层厚度，结果显示中青年原发性高血压患者循环EPCs CD34+水平与心血管危险因素及颈动脉内膜中层厚度呈负相关，认为外周循环EPCs CD34+水平可以作为评估高血压患者早期血管病变的标志之一。孔朝红等[31]对高脂模型大鼠进行EPCs体外分离培养。结果表明，与健康大鼠来源的EPC相比，高脂大鼠EPCs形态较小，数量少且CD34表达率较低。刘华伟等[32]对110例2型糖尿病患者分组进行了空腹静脉血EPCs测定，结果显示2型糖尿病患者外周血EPCs数量减低。张金盈等[33]对冠心病患者与非冠心病患者分别抽取外周血进行EPCs的分离培养，观察其外周血EPCs水平，结果证实冠心病患者外周血EPCs数量减少。Mobarrez等[34]研究发现，吸烟可以短时间（4 h内）使体内EPCs急性动员增加，但是EPCs的增加是因为血管损伤后被释放的，所以说明吸烟是急性血管损伤的迹象。因此长期吸烟是引起血管病变的危险因素，并且抑制EPCs的释放。MacEneaney等[35]在对无吸烟史，无明显心血管疾病的正常体重、超重和肥胖成人的外周血EPCs比较研究中发现，肥胖人群中EPCs的数量低于前两者，而EPCs集落形成能力超重及肥胖者要弱于体重正常人群，提示EPCs数量和功能受损可能是由肥胖导致。

2.2.2 促动员因素 在促血管生长因子中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）的动员作用最为强大[36]。实验证明粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）也具备动员EPCS的能力[37]。

适当的运动也能动员EPCs的增值。龚晓明等[38]对有氧运动对中老年大鼠外周血EPCs增值及黏附力进行了研究，结果表明大鼠外周血EPCs数量及贴壁量明显增加。还有研究证明[39]体育锻炼对冠状动脉疾病（CAD），心脏衰竭（HF）和外周动脉疾病（PAD）等心血管内皮功能和EPCs水平可有益诱发。

此外，治疗AS危险因素的一系列药物在控制症状的同时具有动员EPCs的作用。他汀类药物除其调节血脂作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎性反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功等作用而在调节内皮祖细胞的作用上也备受关注[40-41]。他汀类新药匹伐他汀，按不同浓度添加到人脐静脉血EPCs培养基中，结果显示浓度在0.1 μmol/L时EPCs贴壁数量最多，随着浓度升至1.0 μmol/L时EPCs数目呈逐渐减少趋势，但扔高于对照组[42]。而他汀类药物在被广泛应用的同时，其毒副作用也被重视。一味强调他汀强效降脂的效果，而忽略其安全性是非常危险的。1%～3%的患者在服药最初的3个月内会出现一定程度的肝脏损害[43]。心血管病患者同时会服用其他药物，由于肝脏本身受到损害，将导致其他药物的代谢缓慢而在体内蓄积，产生毒副作用。而与此同时，传统药物在通过动员EPCs来改善AS也被广泛研究。武丽萍等[44]通过对Wister大鼠灌胃造模提取的芪红合剂含药血清来培养人外周血EPCs，并得出结论中药芪红合剂对EPCs的增值有促进作用。沈艺等[45]和季亢挺等[46]分别证实了黄芪甲苷对EPCs具有增殖、黏附及保护作用。万槐斌等[47]也证实了小檗碱联合小剂量阿托伐他汀具有与大剂量相似的调脂、抗感染、促EPCs作用，且更安全，对肝功能的影响更小。除了中药，更有蒙药等少数民族药物对调脂等作用上进行了研究，如孟根杜希等[48]对蒙药达日布八味丸治疗高脂血症进行了观察研究，李姹润等[49]进行了蒙药达日布八味丸对高脂血症大鼠调节血脂的实验研究，结果均显示蒙药达日布八味丸对高脂血症具有显著疗效。蒙药、藏药等民族药物对降血脂，抗AS等病变有效已被文献证实，并且蒙药具有使用方便、安全、成本低等优点。可以认为民族传统药物可能对内皮功能的损伤具有保护作用，而EPCs在内皮损伤后的修复过程中扮演着重要的角色，民族药物对内皮细胞的保护作用是否通过动员骨髓EPCs来修复损伤内皮从而发挥保护血管内皮、防治AS的作用，是有待探索的重要课题。

3 小结

自EPCs的概念被提出来至今，其来源，生物学特性，在动物模型中的作用及临床中的应用等研究已获得了巨大突破，然而仍有很多问题需要进一步解决。对于EPCs表面的特异性标志物至今仍没有一个统一的标准，提取分离纯度更高的EPCs方法还未被解决，体外移植EPCs也还在探索阶段，在人体上研究甚少，同时动员EPCs的最佳途径尚未发现。EPCs的发现是再生医学新的希望，通过增殖EPCs，恢复血管内皮细胞的损伤平衡，缓解、预防AS的发生和发展，减少心血管疾病的发生。但EPCs对血管内皮细胞的再生、修复等机制还有许多问题尚待解决。

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