中药多糖质量控制研究进展

肖作奇

湖南省妇幼保健院，湖南长沙410008

中药多糖质量控制研究进展

肖作奇

湖南省妇幼保健院，湖南长沙410008

本文就近年来常见中药多糖质量控制方法，在总糖含量测定方法、分子量大小和分布测定方法、单糖组成和摩尔比测定方法、杂质检测方法等方面进行综述，希望能够为中药多糖的研究和开发提供一定的参考。

多糖；质量控制；总糖含量；分子量；单糖

多糖由10个或10个以上单糖通过缩合而形成的链状结构的物质。在自然界中，植物、动物、微生物和海洋生物中都有多糖的存在。近年来，已发现不少多糖类物质具有很好的生物活性，如抗肿瘤、免疫促进活性、抗病毒、降血糖、抗凝血等［1］。多糖的多样化生物活性使多糖类药物的开发与研究成为了当前新药研究的热点。

多糖质量控制的问题是多糖类新药研发中的瓶颈问题［2］。多糖是一类分子量相对较大的物质，其结构与蛋白质类似，也可分为一级结构、二级结构、三级结构、四级结构，而多糖的生物与其初级结构和高级结构都有密切的关系。多糖的一级结构就包含分子量大小及分布、单糖组成及摩尔比、糖苷键链接方式、重复结构单元和分支度等多方面的问题。这些问题使多糖的定性和定量检测成为一个很大的难题。现就多糖质量控制的问题，在总糖含量测定方法、分子量大小和分布测定方法、单糖组成和摩尔比测定方法、杂质检测方法等方面进行综述。

1 多糖中总糖含量测定方法

多糖的总糖含量决定了其纯度，是多糖药物质量控制最基本的问题。多糖总糖含量测定一般利用单糖的缩合反应进行显色后用比色法测定；也有直接采用高效液相色谱法（HPLC）测定多糖含量［3］，但由于缺少标准对照和有效检测手段等因素，该方法并未得到广泛认同。

1.1 苯酚/硫酸法

多糖在浓硫酸作用下，迅速水解脱水生成糠醛或糠醛类似物，然后与苯酚缩合生成1种红色化合物，在一定范围内生成物颜色深浅和多糖中总糖含量成线性关系，由此来测定多糖中总糖含量。该法所采用试剂的价格便宜，蛋白质等物质不干扰测定，灵敏度高，故被广泛采用［4-7］。该法需要注意的问题有：已糖在显示后最大吸收波长一般在490 nm处，戊糖和糖醛酸显示后最大吸收波长一般在480 nm处；苯酚在空气中易氧化生成醌类物质，导致吸收波长发生偏离或吸收值不稳定，所以苯酚在使用前一般宜进行重蒸馏，且需要现配现用；不同多糖在使用该法时，苯酚、硫酸用量、反应温度和时间等都需要进行优化。

1.2 蒽酮/硫酸法

多糖在浓硫酸作用下，迅速生成糠醛或糠醛类似物，然后与蒽酮缩合生成一种蓝绿色化合物，在一定范围内生成物颜色深浅和多糖中总糖含量成线性关系，由此来测定多糖中总糖含量。该法和苯酚/硫酸法的不同是一些蛋白质类物质会干扰总糖含量的测定，所以在测定前一般需要通过前处理去掉样品中的蛋白质。该法需要注意的事项有：糖与蒽酮形成的有色物质最大吸收波长一般在625 nm处；蒽酮-硫酸溶液需要现配现用。该法操作步骤较苯酚/硫酸法更为简单方便［8-10］。

1.3 3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法

多糖水解后生产的还原糖与DNS在中性或碱性条件下生成生成3-氨基-5-硝基水杨酸，显棕红色，在一定范围内，反应产物的颜色深浅和还原糖的量成线性关系，由此可用于测定多糖样品中还原糖的含量。该法可测定多糖样品中游离还原糖的含量；同时也可将多糖水解后，测定多糖中总糖的含量。3-氨基-5-硝基水杨酸一般在540 nm处有最大吸收［11-12］。该法不需要用到强酸，反应相对较为温和。

1.4 地衣酚/盐酸法

多糖在盐酸作用下水解脱水生成糠醛和糠醛衍生物，然后和地衣酚结合生成有色化合物，最大吸收波长一般在660 nm处，其颜色深浅和多糖的量成线性关系，由此可用于多糖样品中总糖含量的测定［13］。这种方法一般用于戊聚糖含量的测定。相对前面3种方法，这种方法使用较少。

1.5 滴定法

有斐林滴定法和间接碘量法等［14-15］。斐林滴定法的原理是将质量浓度为0.1 g/mL氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05 g/mL硫酸铜溶液等量混合，硫酸铜和氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀，再与酒石酸钾钠发生反应，生成酒石酸钾钠铜络合物。加热条件下，用多糖样品液滴定，多糖液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成氧化亚铜沉淀，氧化亚铜再与试剂中的亚铁氰化钾反应生成可溶性的化合物，用次甲基兰作指示剂，达到反应终点时，稍过量的还原糖将次甲基兰还原，反应液由蓝色变为无色，即为滴定终点，然后根据多糖液消耗量可计算出多糖液中还原糖的量。该法注意事项有：要求滴定在沸腾状态下进行，操作繁琐。间接碘量法是一种容量分析法，以氧化还原反应为基础，与苯酚/硫酸法和蒽酮/硫酸法相比，操作过程繁琐；而且在滴定的过程当中，要控制好速度，太快或太慢都将影响实验结果；摇动过于剧烈都会使碘少量挥发，使测定产生误差。由于滴定法的诸多弊端，现在一般很少用于糖含量测定。

2 多糖分子量大小和分布测定方法

多糖的分子量大小表示方法有重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）和黏均分子量（Mη）等。重均分子量用不同大小的分子的分子重量统计平均得到的数值，测定方法有光散射法、超速离心沉降速度法和凝胶渗透色谱法（GPC）等。数均分子量就是依据总体分子的个数求出分子量来的，测定方法有气相渗透法、端基分析法、冰点降低法、GPC和膜渗透压法等。采用黏度法测得的分子量称为黏均分子量。多糖药物的分子量一般在一个固定的范围，所以对多糖分子量的检测与其质量稳定性有密切关系。

2.1 凝胶渗透色谱法

GPC是根据不同分子量大小的多糖在凝胶层析柱上的洗脱体积成一定关系的特点来进行分子量大小和分布的测定。需要不同分子量大小的葡聚糖作为标准物质，绘制标准曲线［16-17］。一般而言，分子量越大，洗脱体积越小，分子量越小，洗脱体积越大。现在常用的样品凝胶有Sephadex G系列葡聚糖、Sepharose琼脂糖、Sephacryl丙烯葡聚糖、Bio-Gel聚丙烯酰胺凝胶等。Idris等［18］采用GPC法成功的测定了阿拉伯树胶的分子量大小和分布范围。

2.2 高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）

HPGPC是GPC和HPLC结合的产物，色谱柱有凝胶填料组成。多糖在凝胶色谱柱上洗脱时间（tR）和分子量大小成一定的关系，可先用已知分子量大小的葡聚糖作对照，得到一系列tR，绘制标准曲线，通过多糖样品的tR和标准曲线求得未知多糖样品的分子量大小［19-20］。和GPC相比，HPGPC分析时间更短，操作更加方便，重复性更好，结果可信度更高，但对仪器设备要求更高。由于糖类物质缺少发色团，HPGPC常用检测器有示差折光检测器和蒸发光散射检测器，两种检测器都是通用型检测器，但灵敏度相对紫外、荧光等检测器较差。HPGPC常用的商品化色谱柱有TOSOH TSK-Gel系列、Shodex色谱柱等。Yang等［21］采用HPGPC法测得龙眼肉中1种中性多糖LPS-N的分子量为13.8 kD，两种酸性多糖（LPS-A1和LPS-A2）分子量分别为1382 kD和571 kD。Sun等［22］用HPGPC法测得紫球藻中多糖分子量大小分别有2918.7、256.2、60.66、6.55 kD。Wang等［23］得到的一种绿茶中性多糖分子量通过HPGPC分析为21 247 D。可以说，HPGPC已经成为多糖分子量大小和分布范围测定的首选方法。

2.3 黏度法

黏性液体在流动过程中所受阻力的大小用黏度系数来表示（η）。多糖溶液的特性黏度（η）与聚合物相对分子量之间的关系，可以通过Mark-Houwink经验方程来计算［24］。黏度法测定多糖的分子质量适用的分子量范围为1×104～1×107。该法所需仪器设备简单，操作容易，但结果准确度不高。

2.4 端基法

该法的基本原理是先测定单位重量多糖样品中可测端基（如还原端基）之数，然后再计算多糖的分子量［25］。

其他多糖分子量测定方法还有渗透压法、蒸汽压法、光散射法、超滤法、冰点降低法等。

3 多糖中单糖组成和含量测定方法

天然药物中的多糖一般不是由一种单糖构成的，如宁夏枸杞多糖就是有木糖和葡萄糖组成，且还含有少量的鼠李糖、甘露糖和半乳糖［26］；绿茶多糖含有阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等多种单糖［27］。每一种多糖物质都有其特征的单糖组成和单糖的摩尔比，可见对单糖组成和摩尔比的测定不仅仅在其结构鉴定方面有重要意义，而且也可由于多糖药物的质量控制研究。多糖一般是由一系列分子量大小的物质组成的复合物，现在还无法对其每一个分子量的糖进行定性定量分析。多糖的单糖组成种类和其摩尔比是相对固定的，由此对多糖单糖种类的鉴定和单糖摩尔比的分析做出相应规定，就能在一定程度上对多糖质量进行有效控制。

多糖在进行单糖组成分析前一般要经过水解过程。多糖水解方法一般有酸水解法、酶解法和物理降解法，最常用的是酸水解法。酸水解常用到的酸有盐酸、硫酸、三氟乙酸、乙酸、磷酸等［28-30］。酶解多糖反应较为温和，无副产物或副产物少，但成本相对较高［31］。物理降解常见的有超声波降解法等［32］。

3.1 气相色谱法（GC）

GC法是最常见的用于单糖组成分析的一种方法。糖类物质本身没有很好的挥发性，不能直接进行气相分析，所以必须经过衍生化后才能使用GC进行定性定量分析。用于GC的单糖衍生方法已有许多报道。常用到的衍生化试剂有甲醚、乙酸盐、三氟乙酸盐、三甲基硅醚、三甲基硅烷基肟、三甲基硅烷基烷基肟、糖醇乙酸醋等化合物［33］。Feng等［34］从夏枯草中得到一种多糖P32，用硫酸将其水解后，采用乙酰化反应将其衍生，GC分析结果表明P32多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比值是3.46∶49.32∶58.91∶0.43∶2.64∶3.11。Qin等［35］从泥鳅中得到一种动物多糖，命名为MAP，采用甲酸和硫酸混合将其酸水解，然后用糖醇乙酸醋法将其衍生，通过GC分析得知MAP是半乳糖、岩藻糖和甘露糖组成，其摩尔比值为5∶4∶1。Boldizsar等［36］将一种担子真菌多糖用2 mol/L的三氟乙酸水解后，采用三甲基硅烷法将其衍生化，GC分析结果表明这种真菌多糖含有阿拉伯糖醇（0.01%～10.2%）、阿拉伯糖（0.09%～1.3%）、核糖（0.2%～1.8%）、岩藻糖（0.3%～1.2%）、甘露糖（0.01%～5.3%）、山梨醇（0.01%～0.05%）、果糖（0.08%～0.8%）、半乳糖（0.9%～29%）、葡萄糖（10%～53%）、糖醛酸（0.14%～3.7%）、蔗糖（0.03%～ 2%）、海藻糖（0.2%～1%）、纤维二糖（0.01%～0.6%）、麦芽糖（0.2%～1.9%）等。GC法分析单糖的特点是可同时分析超过10种单糖，准确度高；所需样品量小，能检测到含量很低的单糖。同时，GC法也有很多缺点，如操作繁琐，需要较长时间的衍生过程；必须经过衍生，衍生容易产生副产物，经常1种单糖出现2个或2个以上的异构峰等。

3.2 高效液相色谱法

HPLC也是一种使用较为广泛的单糖组成分析方法，可分为不需柱前衍生和需要柱前衍生两类。不需要柱前衍生的方法一般选用氨基色谱柱（离子排阻色谱柱）等，同时需要配备有示差折光检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器等通用型检测器。柱前衍生的方法一般在先用具有紫外吸收的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）等试剂进行衍生，然后选用C18色谱柱，配备紫外检测器进行分析。Karlsson等［37］采用TSKgel Amide-80色谱柱配备蒸发光散射检测器，使用甲酸铵溶液作流动相，不经过衍生，直接成功对岩藻糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰-D-葡糖胺、乙酰神经氨酸和葡糖醛酸等多种单糖进行定性定量分析。Xu等［38］采用NH2色谱柱配备有示差折光检测器，选用乙腈-水作为流动相，通过HPLC分析得知2种黄芪多糖APS-1是由阿拉伯糖和葡萄糖构成；摩尔比是1∶3.45，ASP-2是由鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖构成，摩尔比为1∶6.25∶17.86。Lv等［39］分析绞股蓝多糖时，选用PMP柱前衍生法，采用C18反相色谱柱和紫外检测器，分析结果表明绞股蓝多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，其摩尔含量别分为6.3、10.3、47.1、5.6、24.0、128.4、25.0、101.4、71.1 μmol/L。Yang等［40］采用Lv等［39］同样的方法分析当归多糖的单糖组成，结果表明不同当归多糖组成但单糖种类和摩尔比例不尽相同，是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖中几种构成。HPLC法相对GC法来说，操作较为简单，没有异构峰产生，分析速度快；但是HPLC法的灵敏度没有GC法高。

3.3 纸色谱法（PC）

PC法是根据不同物质在固定相和流动相中的分配系数不同而实现分离的，其固定相是纸上吸附的水，属于正相分配色谱。Glegg等［41］选用纸色谱成功将鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖分离，其选用的展开剂为乙醇-吡啶-水体系，显色剂选用的是苯胺草酸溶液和二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮溶液。商澎等［42］使用新中华速滤纸，用正丁醇-乙酸乙醋-吡啶-乙酸（25∶10∶10∶13）作为展开体系，苯胺-邻苯二甲酸正丁醇溶液作显色剂，鉴别出当归多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸构成。田光辉等［43］采用PC鉴定中药糙苏中多糖的单糖组成，选用正丁醇-吡啶-水（6∶4∶1）作展开体系，邻苯二甲酸-苯胺作显色剂，发现糙苏多糖中的单糖主要有葡萄糖，还含有少量的果糖和半乳糖。PC需要仪器设备非常简单，操作也简单易行，但是其灵敏度较差，如商澎等［42］在当归多糖中发现的单糖种类就没有Yang等［40］发现得多，而且不能进行定量分析，无法得知单糖的摩尔比值。这些因素使PC的使用越来越少。

3.4 薄层色谱法（TLC）

TLC分为不同的TLC和高效薄层色谱法（HPTLC），常用与多糖的初步分析［44］。Di等［45］采用高效薄层板，选用丙醇-水作展开体系，4-氨基苯甲酸-冰醋酸-磷酸水溶液作显色剂，成功将半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖9种单糖分离，并建立灵芝多糖的指纹图谱，用于不同品种灵芝的鉴别和鉴定。陶俊等［46］利用TLC测定油茶籽中多糖的单糖组成，选用的展开剂是乙酸乙醋-丙酮-甲醇-水（12∶3∶3∶2），选用的显色剂为苯胺丙酮溶液，结果表明油菜籽多糖是由半乳糖、木糖、果糖、半乳糖等组成。江海霞等［47］采用TLC测定不同品种的小通草中多糖的单糖组成，用氯仿-冰醋酸-水（6∶7∶1）作展开剂，用苯胺-二苯胺-磷酸溶液作显色剂，结果显示，喜马山旌节花多糖和中国旌节花多糖是由鼠李糖、果糖、半乳糖组成，青荚叶多糖由半乳糖聚合而成。和PC一样，TLC所需仪器设备简单、操作简单，但其灵敏度较差。

3.5 高效毛细管电泳法（HPCE）

HPCE技术的出现晚于GC和HPLC技术，属于较为前沿的一种分析技术。由于HPCE一般也是配备紫外检测器，所以在进样分析前一般需要进行衍生，PMP也是最为常用的一种衍生试剂。Yang等［48］采用HPCE技术分析南瓜多糖中单糖的组成，现将多糖样品用2.0 mol/L三氟乙酸水解，然后用PMP衍生化，HPCE结构表明南瓜多糖含葡萄糖（21.7%）、葡萄糖醛酸（18.9%）、半乳糖（11.5%）、阿拉伯糖（9.8%）、木糖（4.4%）和鼠李糖（2.8%）。Chen等［49］用HPCE技术分析一种刺五加多糖的单糖组成，同样采用酸水解和PMP衍生的前处理方法，得到的结果表明，该种刺五加多糖含有鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸，其摩尔比值是7.45∶18.63∶25.15∶0.93∶8.35∶2.79∶5.69。HPCE法对仪器设备要求较高，操作相对复杂，但其灵敏度高，是一种检测多糖中单糖组成和摩尔比很好的技术手段。

4 多糖中杂质的检测

天然药物提取得到的多糖中常常含有蛋白质类、核酸、单糖、色素、无机盐等杂质，将多糖中的杂质进行含量限定对多糖质量控制有重要意义。

4.1 多糖中蛋白质的检测

常用于多糖中蛋白质含量测定的方法有考马斯亮蓝法（Bradford法）、BCA法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、紫外分光光度法、凯氏定氮法等。其中紫外分光光度法最为方便快捷，灵敏度较高，但是核酸类物质对其测定有影响，可用于简单的定性分析，样品能够回收。Bradford法和Lowry法的灵敏度最高，但操作相对较复杂，样品不能回收。Chen等［50］采用Bradford法测定3种绿茶多糖中蛋白质含量，采用胎牛血清作为标准物质，3种绿茶多糖（TPC-1、TCP-2、TCP-3）中蛋白质含量分别为2.8%、3.8%和4.3%。Liu等［51］使用Lowry法测定一种蘑菇多糖中蛋白质的含量，发现多糖中蛋白质的含量对多糖抗氧化活性具有直接影响。李石军等［52］使用紫外分光光度法检测一种香菇多糖中是否含有蛋白质杂质，紫外扫描结果表明香菇多糖在260 nm和280 nm处无吸收峰，证明香菇多糖中不含蛋白质。

4.2 多糖中核酸的检测

核酸的常见测定方法有定磷法、紫外分光光度法、地衣酚法、二苯胺法等。紫外分光光度法是依据核酸在260 nm处有最大吸收值来测定多糖中核酸的量，一般认为在260 nm处无吸收峰即不含核酸。

4.3 多糖中游离单糖检测

多糖中常常含有少量游离的单糖或寡糖，不经过水解对多糖进行TLC、HPGPC或HPLC分析常可检测多糖中是否含有游离单糖。也可将多糖样品采用乙醇沉淀，取上清测定样品中游离单糖或寡糖的含量［53］。

多糖中的色素杂质一般经过纯化过程去除干净，可肉眼观察是否还有色素，高纯度的多糖一般都是纯白色或略带黄色的固体粉末状物质，色素含量较高时多糖呈现黑色或深黄色。除色素的方法常有活性炭吸附、大孔吸附树脂、阴离子交换树脂等方法。多糖中无机盐杂质一般是提取纯化过程中引入的，比如酶解法除蛋白质过程中引入的缓冲盐。HPGPC色谱分析图中可明显观察到多糖样品中是否还有无机盐。

5 小结

多糖是当前药物研究的热点，多糖质量的稳定可靠是保证期药效实验可信的重要前提。上述内容就总糖含量测定方法、分子量大小和分布测定方法、单糖组成和摩尔比测定方法、杂质检测方法4个方面进行综述，为多糖质量控制方法研究提供参考和借鉴。但这些方法用于多糖质量控制都存在一点的缺陷，多糖药物的质量控制需要2种或多种方法的相互结合。同时，更有快捷、有效的多糖质量控制方法有待进一步寻找与发现。

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Studies advances on quality control of polysaccharide from traditional Chinese medicine

XIAO Zuoqi
The Maternal and Child Health Hospital of Hu'nan Province,Hu'nan Province,Changsha410008,China

In this paper,the following four aspects were considered to ensure the quality of polysaccharide:total sugar contents,molecular weight,monosaccharide composition and impurity detection,expecting to apply some suggest for research and development of polysaccharides from traditional Chinese medicine.

Polysaccharide;Quality control;Total sugar contents;Molecular weight;Monosaccharide

R284

A

1673-7210（2015）02（a）-0159-06

2014-11-09本文编辑：苏畅）

国家“重大新药创制”科技重大专项项目（编号2011ZX09102-004-02）。

肖作奇（1987-），男，博士，主要从事中药物质基础及质量控制研究。