生长抑制因子5抑制肺癌细胞增殖作用的研究

张旭涛++孟瑾++张峰

[摘要] 目的 探讨生长抑制因子5（ING5）抑制肺癌细胞增殖的作用。 方法 采用慢病毒介导的基因转染方法建立A549细胞ING5高表达细胞系A549-ING5-OE和A549细胞空质粒对照细胞系A549-control。采用细胞增殖实验和克隆形成实验观察ING5过表达对肺癌A549细胞增殖能力的影响；采用皮下接种方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察ING5对裸鼠皮下成瘤能力及肿瘤体积大小的影响。 结果 本实验成功构建了肺癌A549-ING5过表达细胞系，与A549-control比较，细胞系A549-ING5-OE中ING5表达显著增高；增殖实验结果显示ING5高表达显著抑制了肺癌细胞的增殖能力；克隆形成实验结果显示细胞系A549-ING5-OE中ING5高表达的肺癌细胞克隆形成能力明显低于A549-control肺癌细胞（P < 0.01）；裸鼠在体水平研究结果显示ING5高表达可以抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长。 结论 ING5可以抑制肺癌细胞的增殖，为临床治疗肺癌提供新的治疗靶点。

[关键词] 肺癌细胞；生长抑制因子5；增殖；克隆形成；裸鼠成瘤

[中图分类号] R734 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（a）-0004-04

肺癌的发生是个涉及多基因改变的复杂过程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是两大关键要素。生长抑制因子（inhibitor of growth，ING）作为候选抑癌基因家族在肿瘤发生、发展中起重要抑制作用[1]，目前已发现5个成员，包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5[2]。ING编码的蛋白在结构上具有相似性，功能上存在共同的作用，ING蛋白参与磷脂酰肌醇介导的脂类信号通路及激素介导的通路，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡和DNA损伤修复[3-7]，同时ING蛋白也具有各自的特点[8-13]。在多种肿瘤中ING家族基因的表达均下调[7]，已有的研究表明，在肝癌的发生、发展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用[14-15]。ING5作为家族的最新成员于2003年被首次报道。2006年Cote课题组[16]研究揭示ING5参与构成两种组蛋白乙酰基转移酶（HAT）复合体，并且能与组蛋白结合而作为连接HAT与组蛋白的桥梁分子参与组蛋白修饰和染色质重构，表明ING5可通过辅助HAT表观调控基因表达而发挥抑癌作用。ING5与临床肿瘤发生的关系研究表明，61%的原发口腔肿瘤组织中ING5 mRNA水平降低，31例中有3例检测到ING5基因发生突变；在肝癌组织中ING5 mRNA表达量下降，起到抑癌基因的作用[17]；在食管鳞癌组织中ING5 mRNA的表达量同样下降[18]。进一步研究表明ING5可与P53相互作用，并促进P53转录活化，而引起结肠癌细胞周期阻滞和凋亡[19]。但ING5在肺癌中的作用尚未见报道，本实验拟建立ING5高表达肺癌细胞株，采用细胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探讨ING5对肺癌细胞的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞（中科院上海细胞库），GV218载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司，蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、细胞裂解液均购自西安碧云天科技生物有限公司，蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche，G418购自美国Gibco，细胞培养液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均购自美国HyClone，青链霉素混合液购自北京Solarbio，ING5抗体购自美国Proteintech，ECL化学发光试剂盒购自美国Advansta，兔二抗购自英国Abcam，电子游标卡尺购自哈尔滨量具刃具有限责任公司，4%多聚甲醛购自西安科昊生物技术有限公司，裸鼠由第四军医大学（以下简称“我校”）实验动物中心提供。

1.2 GV218慢病毒载体转染构建A549-ING5-OE和A549-control细胞系

含ING5 cDNA的慢病毒载体和对照载体为吉凯公司构建。用胰蛋白酶消化液消化293T细胞，计数，调整细胞密度为6×105个/mL，接种于细胞培养皿，待细胞密度达80%时进行转染。转染前2 h将培养液换成无血清培养液，将转染复合物加入293T细胞培养液中，培养8 h后弃掉含有转染复合物的培养液，用PBS清洗细胞，加入10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养。48 h后收集293T细胞上清液，1000 r/min离心除去细胞碎片，收集上清即为病毒颗粒浓缩液。对数生长期A549细胞，培养液中加入病毒颗粒浓缩液进行感染，12 h后观察细胞状态，没有明显的细胞毒副作用，继续培养24 h后更换新的培养液，感染3 d后观察GFP基因的的表达。感染后A549细胞计数，调整密度为300个/孔，接种至6孔板，用G418筛选，药物浓度为5 μg/mL，每隔24 h更换新的培养液，筛选3 d后，用荧光显微镜观察细胞克隆，挑取阳性克隆扩大培养，直至获得需要的细胞量。

1.3 Western blot检测ING5在A549-control和A549-ING5-OE细胞中的表达

收集对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞在冰上裂解30 min，细胞裂解液为150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5% 去氧胆酸、0.1%SDS、50 mmol/L Tris（pH 8.0），蛋白酶抑制剂（1∶25），裂解后高速离心20 min，收集上清即为细胞总蛋白，蛋白定量试剂盒定量。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制10%的凝胶。电泳，样品在浓缩胶电压100 V，20 min，在分离胶电压120 V继续电泳。转膜，电压55 V，210 min，转膜结束后用丽春红染液染色，PBST脱色。牛奶封闭1 h，一抗ING5（1∶1000）封闭4℃过夜。PBST洗3次，每次5 min，二抗封闭1 h，PBST洗3次，每次5 min。用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（Amersham Bioscience）检测蛋白的表达。

1.4 检测ING5对肺癌细胞增殖的抑制

将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整细胞密度为1×104个/孔，接种至24孔板，两种细胞各种4个复孔，每孔加1 mL 10%胎牛血清DMEM培养液。从细胞贴壁开始计时24、48、72、96 h后各计数1次。

1.5 检测ING5对肺癌细胞克隆形成能力的抑制

将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整细胞密度为300个/孔，接种至6孔板，每孔加2 mL 10%胎牛血清DMEM培养液。细胞接种5 d后每孔各加500 μL胎牛血清继续培养。贴壁生长15 d后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%结晶紫溶液染色15 min，PBS轻轻冲洗细胞，室温风干后计数多于50个细胞的克隆。根据公式计算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆数/300×100%。

1.6 ING5抑制裸鼠皮下成瘤实验

出生4周雄性裸鼠，对照组和实验组各7只随机分组，由第四军医大学（以下简称“我校”）实验动物中心代养。裸鼠适应7 d后，将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整密度为每只裸鼠5×106个/200 μL，混匀在无血清DMEM培养液，分别接种至对照组和实验组裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤，每隔3 d用电子游标卡尺测1次移植瘤长径（a）和短径（b），并计算肿瘤体积（V）：ab2/2，绘制肿瘤生长曲线。裸鼠实验遵循我校关于动物保护和做好动物福利规定，并经我校实验动物伦理委员会批准。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测ING5蛋白表达

为了检测ING5是否在所转染细胞中高表达，将A549-control和ING5高表达细胞对数生长期时用细胞裂解液提取总蛋白，Western blot结果显示与A549-control相比，ING5在A549-ING5-OE细胞中表达量显著增高。见图1。

图1 ING5在A549-ING5-OE细胞中的表达情况

2.2 ING5抑制肺癌细胞增殖

显微镜下观察可见A549-control和A549-ING5-OE细胞生长良好，紧密排列，形态为梭形，细胞之间形成连接。A549-ING5-OE细胞的增殖速度明显低于A549-control细胞，增殖速度为A549-control的一半，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

与A549-control比较，**P < 0.01

图2 A549-control与A549-ING5-OE细胞增殖曲线

2.3 ING5抑制肺癌细胞克隆形成能力

A549-control和A549-ING5-OE细胞接种在6孔板15 d后，计数细胞数多于50个的克隆，结果表明与A549-control相比ING5高表达肺癌细胞的克隆形成能力明显降低，A549-ING5-OE细胞的克隆形成率为A549-control细胞的50%，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

2.4 ING5抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长

裸鼠皮下接种A549-control和A549-ING5-OE细胞，7 d后成瘤，随着时间的增加，接种A549-control裸鼠肿瘤生长较快，接种A549-ING5-OE的裸鼠肿瘤生长明显较慢，结果表明ING5高表达后显著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长。见图4。

图4 生长抑制因子5抑制裸鼠皮下种植瘤的生长

2.5 接种A549-ING5-OE及A549-control细胞后大鼠体积变化情况

接种A549-ING5-OE细胞成瘤，肿瘤体积大小基本无增加。A549-control细胞接种成瘤，肿瘤体积明显增大。从肿瘤生长曲线可以看出ING5高表达的肺癌细胞肿瘤生长明显被抑制，肿瘤体积较对裸鼠A549-control细胞接种显著减小。见图5。

图5 肿瘤生长曲线

3 讨论

作为候选抑癌基因家族成员，近年来ING家族在肿瘤发生、发展过程中的作用和机制受到越来越多的关注。路美玲等[17]研究结果表明，与正常肝组织相比，肝癌细胞株ING5 mRNA表达明显降低，在肿瘤转化过程中与正常组织相比ING5表达明显被抑制。赵春阳等[18]研究结果表明，在肿瘤细胞中ING5表达水平越低，肿瘤的恶性程度就越高。

研究表明，肺癌的发生、发展以及侵袭、转移是多基因参与、多步骤发生的过程[19-20]。随着近年来外科技术发展的日趋完善，新的化学治疗药物和局部治疗方法不断出现，但对肺癌的总体治疗效果却不甚理想，因此从分子水平研究肺癌发生、发展中的分子机制，针对肺癌中异常分子的治疗药物和治疗方法就成了新的研究热点，并促进了肺癌分子靶向治疗的出现。本研究中，通过慢病毒介导的基因转染方法使ING5在A549细胞中高表达，发现ING5高表达后与对照肺癌细胞相比，其增殖能力和克隆形成能力均降低，说明在细胞水平ING5抑制了肺癌细胞的增殖和克隆形成能力。通过裸鼠在体水平的研究同样发现，ING5抑制了裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长，动物实验研究结果同样说明ING5抑制了肺癌细胞的增殖，与上述细胞实验结果相符。

综上所述，ING5在肺癌细胞高表达后抑制了肺癌细胞的增殖，提示ING5在肺癌的发生和发展中起到了抑癌基因的作用，为肺癌的基因治疗提供了新的靶点。

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（收稿日期：2014-11-14 本文编辑：任 念）