秦西平,潘洪玉,徐芝龙,程风春
(1.临沂市兰陵县人民医院,山东 临沂 277799;2.滨州医学院附属医院,山东 滨州 256600)
检测高尔基体蛋白73及其基因表达对原发性肝癌的诊断价值
秦西平1,潘洪玉1,徐芝龙1,程风春2
(1.临沂市兰陵县人民医院,山东 临沂 277799;2.滨州医学院附属医院,山东 滨州 256600)
目的:探讨高尔基体蛋白73(GP73)血清及其基因表达在原发性肝癌(PHC)中的诊断价值,分析GP73在PHC诊断及高危人群普查的临床意义。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和电化学发光免疫技术定量检测85例PHC、46例肝硬变患者和102名健康人的血清GP73、AFP水平,计算GP73的敏感度、特异度和受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积,采用实时荧光定量(RT-PCR)法检测各组外周血单个核细胞GP73 mRNA的相对表达量,以Ct值比较法计算GP73 mRNA相对表达水平,同时检测12份正常肝组织和12份肝癌组织的GP73 mRNA相对表达水平。结果:PHC组和肝硬变组患者的GP73中位血清质量分数分别为295.6 μg/L、213.9 μg/L,PHC组GP73中位血清质量分数较肝硬变组明显升高,有显著性差异(P<0.05)。PHC组和肝硬变组患者的AFP中位血清质量分数分别为9.6 μg/L、7.0 μg/L,无显著性差异(P>0.05)。GP73诊断肝癌的敏感度(72.7%)高于AFP(49.8%),有显著性差异(P<0.05),GP73特异度(70.8%)低于AFP(95.9%),有显著性差异(P<0.05)。GP73和AFP联合检测肝癌的敏感度为79.6%,特异度为80.3%,ROC曲线下面积为0.840(95% CI为0.770~0.919);全血GP73 mRNA含量3组间无显著性差异(P>0.05),肝癌组织GP73 mRNA表达量(12.87)明显高于正常肝组织(1.08),有显著性差异(P<0.05)。结论:GP73诊断PHC具有较好的敏感度,GP73与AFP联合检测可进一步提高诊断早期肝癌的敏感度。全血标本GP73 mRNA检测不能作为诊断原发性肝癌的肿瘤标志,肝组织标本GP73 mRNA可为诊断原发性肝癌的肿瘤标志,但存在创伤大、风险大等弊端。血清GP73联合AFP检测可显著提高PHC诊断,二者联合可用于PHC高危人群的普查及筛选。
原发性肝癌;高尔基体蛋白73;甲胎蛋白;基因
原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,全世界范围内发病率和死亡率都很高,5年总体生存率不大于10%[1]。世界上每新增加10例PHC患者,就有一半发生在中国[2]。大多数PHC患者有肝硬变等肝脏疾病史,发病初期可能没有任何症状,明确诊断时多已是中晚期,且常伴有其他部位的转移,治疗效果极差。因此,寻求肝癌的早期诊断方法尤为重要。甲胎球蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)长期以来被认为是诊断PHC最有价值的肿瘤标志物,但在PHC发展的早期阶段其敏感度较低。GP73是高尔基体Ⅱ型跨膜蛋白,健康人群可有表达,但含量极低,但在肝硬变和PHC患者中,血清GP73表达显著升高[3-4]。所以有报道认为,血清GP73可能成为肝癌早期诊断的重要方法[4]。然而肝癌患者GP73基因表达水平如何,血清GP73与AFP联合检测对诊断PHC有何意义,这些问题尚不明确。本研究通过检测早期肝癌、肝硬变患者血清GP73水平及外周血、部分肝癌组织的GP73 mRNA表达水平,进一步评价对GP73、GP73 mRNA与AFP联合检测PHC的效能。
1.1 研究对象 收集2012年11月至2014年1月兰陵县人民医院明确诊断的PHC患者和肝硬变患者作为研究对象。(1) PHC组85例,其中:男69例,女16例;年龄60.5±10.4岁。肝癌诊断符合《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[5]。(2)肝硬变组46例,其中:男39例,女7例;年龄59.6±11.2岁。肝硬变诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》[6]中肝硬变诊断标准。另选取门诊健康体检者102例作为对照组,其中:男78例,女24例;年龄56.3±9.2岁。另同期收集确诊PHC并进行肝癌切除术患者的肝癌组织及尸检的非医源性正常肝组织各12份。各组年龄、性别无显著性差异(P>0.05)。本研究经我院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。
1.2 标本采集 抽取待检者清晨空腹静脉血6 mL,取3 mL加入抗凝剂试管中,室温静置1 h,随后1 000 r/min离心10 min,分离血清后置-40℃冰箱保存,用于检测GP73蛋白和AFP。取3 mL血清置EDTA抗凝剂的试管中,用于提取单个核细胞的RNA。RNA提取在6 h内完成。
1.3 逆转录合成cDNA 应用25 μL PCR体系,PCR上游引物(10 μmoL/L)1.6 μL、PCR下游引物(10 μmoL/L)1.6 μL、DNA模板2 μL、灭菌蒸馏水4.8 μL。反应条件:首先94 ℃预变性 5 min,然后94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s开始循环,共循环35次,最后72 ℃延伸10 min。
1.4 PT-PCR检测GP73 mRNA 从GenBank中获取GP73基因,应用Primer Express软件分析基因序列,根据文献[7]提供的引物设计原则,在这些序列的保守区域筛选1对引物。GP73上游引物序列为5’-CAGCGCTGATTGAGATGA-3’,下游引物序列为5’-ATGATCGTGTCTGGAGGTC-3’,目的基因长度为153 bp。β-actin上游引物序列为5’-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3’,下游引物序列为5’-GTGTTGGCGTACAGGTCTITG-3’,目的基因长度为459 bp。
1.5 检测结果判断 以GP73 mRNA与β-actin检测Ct值之差(⊿Ct)作为评价GP73 mRNA相对表达水平的指标。靶基因GP73 mRNA的相对量按公式靶基因=2-⊿⊿Ct计算,其中⊿⊿Ct =⊿Ct(Q)-⊿Ct(C),⊿Ct(Q)为疾病组靶基因的Ct值与管家基因Ct值之差;⊿Ct(C)为对照组靶基因的Ct值与管家基因Ct值之差。
1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。呈非正态分布的数据,用中位数(4分位数)M(95%可信区间)表示。多组比较采用Kruskal-WallisH检验,两两比较采用Mann-WhitneyU检验(Bonferroni校正检验水准后调整为0.05)。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)计算临界值、敏感度、特异度和ROC曲线下面积。各组织标本中的GP73 mRNA表达量比较采用t检验,检验水准α=0.05。
2.1 各组血清GP73、AFP、GP73 mRNA检测 结果详见表1。
表1 各组GP73、AFP及GP73 mRNA检测结果比较[M(95%可信区间)]
注:1)与PHC组GP73比较P<0.05
PHC组血清GP73中位质量分数较肝硬变组明显升高(P<0.05);2组AFP中位血清质量分数无显著性差异 (P>0.05),但PHC组和肝硬变组GP73、AFP血清中位质量分数均显著高于健康对照组(P<0.05);全血GP73 mRNA含量3组间无显著性差异(P>0.05)。
2.2 血清GP73、AFP诊断PHC的敏感度、特异度和受试者工作特征曲线(ROC曲线)比较 结果详见表2。
表2 血清GP73、AFP和二者联合检测诊断PHC的效能比较
确定血清GP73和AFP诊断PHC的临界值分别为181.3 μg/L和15.4 μg/L,GP73诊断肝癌的敏感度高于AFP(P<0.05),GP73特异度低于AFP(P<0.05)。血清GP73和AFP联合检测肝癌的敏感度为79.6%,特异度为80.3%,ROC曲线下面积为0.840(95% CI为0.770~0.919),与AFP的ROC曲线下面积比较无显著性差异(P>0.05),GP73、AFP诊断PHC的ROC曲线分别为0.751、0.726。
2.3 正常肝组织、肝癌组织GP73 mRNA表达量比较 结果详见表3。
表3 肝癌组织与正常肝组织GP73 mRNA表达量比较
注:1)肝癌组织与正常肝组织比较t=8.490,P<0.01
肝癌组织GP73 mRNA表达量明显高于正常肝组织 (P<0.01)。
近年来我国PHC的发病率和病死率呈逐年上升趋势,早期诊断和治疗不仅可改善PHC患者的预后,也可以节省大量医疗资源。AFP是目前应用最广泛的诊断原发性肝癌的血清标志物,但其敏感度仍不够理想,寻找肝癌早期阶段新的血清肿瘤标志物具有重要的临床价值。国内外研究表明,血清GP73在PHC诊断方面的敏感度优于AFP,有望成为新型血清肿瘤标志[8]。然而,目前大多数研究仅限于血清水平,有关GP73在PHC及肝脏疾病患者血浆中及肝癌组织中的mRNA表达量的研究较少。
GP73主要在胆管上皮细胞表达,正常肝细胞表达很少甚至不表达。Block等[9]和Jiang等[10]研究表明血清GP73在PHC中可显著升高,对PHC早期检测有着良好的应用前景。Zhou等[11]的一项Meta研究表明:血清GP73的敏感度为76%,稍优于AFP的敏感度70%;特异度86%,稍低于AFP特异度89%;ROC曲线下面积0.88,稍优于AFP的ROC曲线下面积0.86,但无显著性差异。故认为血清GP73与AFP对PHC的诊断性能无显著差异,两者联合检测的性能评价需要进一步的研究。本实验分析结果显示PHC组血清GP73水平较健康对照组明显升高,GP73诊断肝癌的敏感度高于AFP,但GP73的特异度低于AFP。提示血清GP73在肝硬变高危人群中诊断PHC具有较好的敏感度,但特异度相对较差,与上述报道[11]不相符。笔者认为本研究结果与Zhou报道差异甚大的主要原因是在ROC曲线中对特异性要求过高,而忽视了灵敏度指标。AFP检测与GP73和AFP联合检测的ROC曲线下面积无显著性差异,提示AFP单项与联合GP73检测,对PHC的诊断效能相似。这与Zhou等[11]的报道相符合。但本研究结果显示,GP73和AFP联合检测的敏感度高于GP73单项诊断,提示GP73与AFP联合检测可进一步提高PHC患者诊断的敏感度。
本研究在检测PHC患者血清GP73的基础上,继续深一步探讨各实验组血清GP73 mRNA的表达量及肝癌组织与正常组织GP73 mRNA的相对表达水平。我们使用实时荧光定量PCR方法,从Genbank中获取GP73基因,应用Primer Express软件分析基因序列,对血清和肝癌组织标本进行GP73 mRNA进行检测。结果显示PHC患者GP73 mRNA在全血中的表达量很微弱,其含量与肝硬变、对照组比较无显著性差异。所以全血GP73 mRNA检测对PHC没有诊断价值。这可能是因为GP73 mRNA主要存在于肝癌细胞中,血液中几乎很难检测到。这与Tian等[12]的报道一致。我们通过对肝癌组织及正常肝组织GP73 mRNA水平对比发现,肝癌组织GP73 mRNA表达量明显高于正常肝组织,其表达量大约是正常肝组织的13倍,提示肝癌组织GP73 mRNA表达量明显升高,所以我们认为肝组织GP73 mRNA检测对PHC是一个较好的指标。但是考虑肝组织取材难、创伤大、患者痛苦等弊端,使其应用受限。
综上所述,高尔基体蛋白73可作为一种新的诊断PHC标志,具有较好的敏感度。全血标本的GP73 mRNA指标不能作为诊断PHC的肿瘤标志,肝组织标本GP73 mRNA检测可作为诊断PHC的肿瘤标志,但存在取材难等缺点,应权衡利弊。血清GP73联合AFP检测,能有效提高早期PHC患者的诊断敏感度,为早期PHC诊断提供有效途径,可应用于PHC高危人群的普查及筛选。
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Value of Detecting Golgi Protein 73 in Plasma and Gene Expression for the Diagnosis of Primary Liver Cancer
QIN Xiping1, PAN Hongyu1, XU Zhilong1, CHENG Fengchun2
(1.Linyi Lanling People's Hospital,Shandong Linyi 277799,China; 2.The Hospital of Binzhou Medical College,Shandong Binzhou 256600,China)
Objective:To investigate the value of Golgi protein 73 (GP73) and gene expression in the diagnosis of hepatocellular carcinoma(PHC); to analyse the clinical significance of serum GP73 in diagnosis of PHC for screening of high-risk groups.Methods:Took enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) quantitative detection of serum GP73 and AFP levels in 85 cases of PHC, 46 patients with cirrhosis and 102 healthy people. Calculated the sensitivity, specificity, and receiver operating characteristic curve under GP73 area(area under the ROC curve), real-time quantitative(RT-PCR) was used to detect the relative expression of GP73 mRNA in mononuclear cells in peripheral blood in each group, GP73 mRNA relative expression levels were detected with ct value comparison method,simultaneously explored the 12 GP73 mRNA in normal liver tissue and the 12 HCC tissues relative expression levels.Results:Serum concentrations of GP73 median in PHC group and cirrhosis patients were 295.6 μg/L,213.9 μg/L.The GP73 median serum concentration difference between the two groups were statistically significant(P<0.05). The median serum AFP concentrations in patients with PHC and cirrhosis were 9.6 μg/L,7.0 μg/L.The serum AFP concentration difference between the two groups were no significant difference(P>0.05).GP73 diagnostic sensitivity of hepatocellular carcinoma (72.7%) was higher than the AFP(49.8%,P<0.05); GP73 specificity(70.8%) was lower than the AFP(95.9%,P<0.05).GP73 and AFP united detection sensitivity for hepatocellular carcinoma was 79.6%, specificity 80.3%;the area under the ROC curve was 0.849(95%CI of 0.770~0.919);whole blood GP73 mRNA showed no significant difference among the three groups(P>0.05),GP73 mRNA expression of hepatocellular carcinoma (12.87) was significantly higher than in normal liver tissue(1.08). Conclusion:GP73 in PHC has better diagnostic sensitivity,GP73 and AFP united detection can further improve the early diagnosis of liver cancer.GP73 mRNA detection in whole blood samples cannot be used as a diagnostic marker of primary liver cancer;liver tissue samples GP73 mRNA can be as tumor markers in the diagnosis of primary liver cancer,but have with trauma and risks.AFP serum GP73 united detection can significantly improve the diagnosis of PHC;their combination can be used to PHC screening in high-risk populations.
primary liver cancer;golgi protein 73;alpha-fetoprotein(AFP);gene
秦西平,xuqinxuqin1986@qq.com
R735.7 <[文献标志码]A class="emphasis_bold">[文献标志码]A DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2015.05.005[文献标志码]A
10.11851/j.issn.1673-1557.2015.05.005
A DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2015.05.005
http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20150918.1750.028.html
2015-01-16)