大鲵黏液低聚糖肽抑菌、抗血小板聚集活性研究

陈丽萍，蔡剑雄，王 剑

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.上海师范大学 工程食品研究所，上海 徐汇 200234)



大鲵黏液低聚糖肽抑菌、抗血小板聚集活性研究

陈丽萍1，蔡剑雄2*，王 剑1

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.上海师范大学 工程食品研究所，上海 徐汇 200234)

目的：充分利用大鲵资源，研究大鲵黏液低聚糖肽的抗血小板聚集、体外抑菌等生物活性。方法：采用全血电阻法血小板聚集试验、体外抑菌实验对大鲵黏液低聚糖肽进行生物活性研究。结果：血小板聚集试验：胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶三种酶酶解产物均对ADP诱导的血小板聚集有抑制作用，其聚集度分别为(4.73±2.20)、(6.80±0.98)、(6.13±0.76)，抑制率分别为48.98%、26.65%、33.87%。体外抑菌活性实验：大鲵黏液不同酶解产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌两种菌的抑菌效价>1∶2.5，其抑菌作用均不显著。结论：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶大鲵黏液酶解产物具有显著抗血小板聚集作用，大鲵黏液及其酶解产物没有显著抑菌作用。

大鲵黏液；抑菌；抗血小板聚集；生物活性

中国大鲵(Andrias davidianus)是我国特有的两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科的珍稀动物，属于国家二级保护动物和传统名贵药用动物[1]。国内大鲵生产和研究开发多集中在皮肤、肉、骨骼等，而有关大鲵体表——尤其是大鲵皮肤分泌物黏液的研究报道相对较少，同时大鲵资源开发迄今尚未形成效益显著可持续绿色发展的大鲵资源深加工技术产业链，从而阻碍了大鲵资源进一步的生产开发利用[2-4]。素有“活化石”之称的大鲵在长期进化适应过程中，其体表形成了良好的防御机制和丰富的生物学特性，同时研究证实大鲵体表分泌物酶解低聚糖肽在心血管系统疾病、抗衰老、保健与免疫功能等新药研发中都具有相当的潜力与良好的应用前景[2,5-8]。本实验前期采用正交优化设计法得到不同商品酶解大鲵体表黏液的最佳酶解工艺条件，然后探究大鲵不同酶解低聚糖肽的抗血小板聚集、抗菌等生物活性，为进一步开发利用大鲵黏液可持续的生物资源在改善血液循环障碍、防止血栓形成方面提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鲵黏液，采用无创提取技术获得(广州华宝珍稀水产养殖有限公司)；SD大鼠5只，体重(150±15)g，购于广州中医药大学实验动物中心；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶(北京鼎国生物技术发展中心)；菌种：金黄色葡萄球菌(Sta.aureus，26112)、大肠埃希菌(E.coli，44113)，菌种均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器与试剂

QX-200全血血小板聚集仪(上海医大仪器厂)、紫外可见分光光度计、ADP(大连美仑生物技术有限公司)、其他所有试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 全血血小板聚集专用稀释缓冲液配制 NaCl 8.0g，MgCl·6H2O 0.427g，CaCl20.2g，KCl 0.2g，D-glucose1.0g，NaHCO31.5g，NaH2PO4·2H2O 0.065g，Heparin(肝素)2 000U，加0.1%迭氮钠1mL，5℃保存，与抗凝全血的稀释比为1∶1，pH=7.4。当发现溶液混浊或者长霉菌不得使用。

1.3.2 凝聚剂配制 精密称定ADP约0.0854g，用稀释缓冲液定容于10mL容量瓶中，即为20mmol/L，精密量取该溶液5mL稀释并定容成10mL即得10mmol/L聚集剂。

1.3.3 供试品溶液 称取大鲵黏液粉末样品研磨成匀浆，称取约0.5g，用蒸馏水定容至100mL，静置10～30min过滤，滤液定容至100mL备用。

1.3.4 ADP诱导全血血小板聚集实验 应用电阻法进行血小板聚集指数，酶解产物重复3次，取平均值。①用定量仪器取0.5mL抗凝全血再加0.5mL全血稀释，再加药物或者对照液350μL，37℃温育5min，移入搅拌珠；②待温度稳定后，插入铂丝电极，启动“搅拌”测定按键，调零定标；③待调整完毕后，加入5μL ADP诱导剂，同时按下“定时”键，5min后锁定平板，记录数值，以最大聚集度(Ω值)表示。

1.3.5 大鲵黏液抑菌活性测定 (1)大鲵黏液抑菌实验前处理：按照无菌滤膜和灭菌分别处理，并将中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、大鲵黏液多糖的酶解产物分别记录为ZL、YL、ML、DL、ZR、YR、MR、DR。(2)试管法测定大鲵黏液抑菌活性[12]：以试管法作抗菌强度定量试验，常规培养后观察得到最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。实验时，用营养肉汤将样品分别稀释，从1∶2.5开始稀释(即1份样品加1.5份营养肉汤)。每排药液的各个浓度管及空白对照管分别加入1∶2 000的试验菌液(8h培养物)0.1mL，37℃培养24h观察结果。判定最小抑菌浓度(MIC)，MIC是指完全抑制试验菌种生长所含的最低药物浓度。

1.4 统计学分析

所有数据录入SPSS17.0统计软件包进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鲵黏液低聚糖肽体外对ADP诱导全血血小板聚集实验

不同酶解产物均对ADP诱导的聚集血小板有抑制作用，且两两间抑制效果不同(F=4.618，P=0.027<0.05)。通过LSD多重比较分析可知，木瓜蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解与空白血样组差异显著(P=0.036、P=0.007)，而中性蛋白酶酶解未达到显著水平(P=0.083>0.05)。三种酶解产物与阿司匹林组抑制血小板聚集相比差异并不显著。详见表1。

表1 低聚糖肽体外对ADP诱导全血血小板聚集实验 (±s)

注：与阿司匹林比较，*P<0.05。

2.2 大鲵黏液低聚糖肽体外抑菌实验

采用对倍稀释试管法。抗菌实验按表2实施，以1～9管均含有倍比稀释的药液，逐一加入菌液、肉汤等，并将实验材料充分混匀后，培养24h，观察实验结果。药液对照管以第9管无细菌生长，菌液对照管第10管有细菌生长，实验方为有效。以抑制试验菌生长的药液最高稀释度为该药液对该试验菌的抗菌效价。以能抑制试验菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度MIC。

4种无菌滤膜处理以及4种高温灭菌在1∶2.5浓度以及以下稀释液均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌没有明显的抑菌效果。结果见表3。

表2 大鲵黏液抗菌实验

注：菌液为8h肉汤培养物，1∶2 000稀释，混匀后37℃培养，24h观察结果。

表3 8种处理液抗菌效价

表3内数字代表抗菌效价，以能抑制试验菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度MIC，而>1∶2.5表示在此浓度下实验没有抑菌作用。空白对照管的试验菌种生长正常。

3 讨论

3.1 ADP诱导全血血小板聚集实验

血小板聚集实验研究中为了使得检测结果能够更加反映体内状态和情况，采用电阻法进行测定。电阻法系根据血小板聚集在电极上增厚使电阻增大的原理，动态反映血小板聚集的全过程[13]。实验结果表明:大鲵黏液低聚糖肽能够在体外抑制ADP诱导的血小板聚集作用，且胰蛋白酶、木瓜蛋白酶抑制效果显著。推测原因是大鲵低聚糖肽与ADP相互作用键合，从而阻碍了ADP与细胞表面受体结合。本实验血小板聚集研究结果与冯叙桥等[9]研究结果相似。

大鲵黏液低聚糖肽抗血小板聚集作用研究为临床用于血栓栓塞性疾病的治疗提供了一定的实验和理论依据，同时可能对伴有血小板聚集性增高的高血压、动脉粥样硬化的防治有一定的临床价值。

3.2 试管法研究体外抑菌作用

实验结果提示大鲵黏液以及酶解产物均无抗菌作用。研究结果与陈德经等人的研究报道不一致。陈德经等人[10]研究显示大鲵皮肤对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有明显的抑菌效果，抑菌力分别为157.1%、90.7%、78.1%，而对大肠杆菌没有抑制作用。皮肤黏液、大鲵肉、大鲵油对四种菌均无抑制作用，说明大鲵的主要抗菌部位为皮肤。

通过比较文献对大鲵黏液的处理，结合抗菌肽物质作为蛋白质的理化性质及其作用机制，推测本实验研究方法中采用酶解法可能将具有抗菌物质的多肽活性成分破坏，同时采用无菌滤膜也可能将抗菌肽物质阻隔在滤膜中。另外，抗菌肽活力及其稳定性易受到蛋白酶、电解质、pH变化的影响，从而导致其抗菌作用波动大[15]。

综上所述，大鲵黏液酶解产物抑菌效果需要通过实验进一步证实，而大鲵低聚糖肽具有显著抑制血小板聚集作用，但需要进一步研究低聚糖肽抗血小板聚集机制，以期发现预防血栓性疾病的药物先导物，进而为大鲵黏液的天然药物开发利用打下基础。

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(责任编辑：魏 晓)

Research on the Antiplatelet Aggregation and Antibacterial of the Giant Salamander Mucin Oligosaccharide Peptide

Chen Liping1，Cai Jianxiong2*，Wang Jian1

(1.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China; 2.Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

Objective:Make full use of resources of Chinese giant salamander, Studying the giant salamander mucin oligosaccharide peptide on antiplatelet aggregation, antibacterial in vitro activity.Methods:Research on biological activity of the giant salamander mucin oligosaccharide peptide is adopting the whole blood impedance platelet aggregation test and antibacterial in vitro experiment. Results:The Platelet aggregation test: the three enzyme Trypsin, neutral protease and papain products were on inhibition of the ADP induced platelet aggregation. The concentration class were (4.73±2.20),(6.80±0.98),(6.13±0.76), respectively.The inhibition ratio were 48.98%、26.65%、33.87% separately. The antibacterial activity in vitro experiment: the potency, was more than 1∶2.5, suggesting that the inhibitory effects were not significant. Conclusion:Trypsin and papain enzymolysis products giant salamander mucus has significant effect of anti-platelet aggregation while the giant salamander mucus and its hydrolyses had no inhibitory effect.

Giant Salamander Mucus; Antibacterial; Antiplatelet Aggregation; Biological Activity

2014-08-19

陈丽萍(1994-),女， 广州中医药大学在读生。

蔡剑雄(1989-) ，男，上海师范大学工程食品研究所硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学、药学。

R282.7

A

1673-2197(2015)01-0011-03

10.11954/ytctyy.201501006