HPLC-ELSD法测定芪黄通秘软胶囊中黄芪甲苷含量

段春改，陈 钟，李 菲，姜国志*，张岩岩

(1.河北省食品药品监督管理局药品认证审评中心，河北 石家庄 050091； 2.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)



HPLC-ELSD法测定芪黄通秘软胶囊中黄芪甲苷含量

段春改1，陈 钟2，李 菲2，姜国志2*，张岩岩2

(1.河北省食品药品监督管理局药品认证审评中心，河北 石家庄 050091； 2.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)

目的：建立芪黄通秘软胶囊中黄芪甲苷含量的测定方法。方法：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(75∶25)，流速为1.0mL·min-1，柱温为35℃，漂移管温度为105℃，载气流速为2.0L·min-1。结果：该方法专属性良好,黄芪甲苷线性范围为1.832～5.496μg(r=0.999)，加样回收率为99.70%，RSD为1.12%，耐用性良好。结论：该方法重现性好、灵敏、准确，可作为芪黄通秘软胶囊质量的控制方法。

HPLC-ELSD；芪黄通秘软胶囊；黄芪甲苷

芪黄通秘软胶囊由黄芪、何首乌、当归、肉苁蓉、黑芝麻等共十一味药材组成，具有益气养血、润肠通便的功效，用于功能性便秘辨证证属“虚秘”者[1]，是神威药业集团独家研制品种。方中黄芪为君药，主要含皂苷类、黄酮类、多糖类及氨基酸类成分等，黄芪总皂苷(AST)具有免疫调节、护肝作用[2]，其中黄芪甲苷(AST-Ⅳ)为活性指标成分，也是特征成分之一[3]。为了更好地控制本品的质量，保证检测黄芪甲苷含量的准确性，确保临床疗效，本文建立HPLC-ELSD法测定芪黄通秘软胶囊中黄芪甲苷含量的方法，并对该方法进行了方法学验证，结果显示该方法重现性好、灵敏、准确，可作为芪黄通秘软胶囊质量的控制方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，Alltech 2000 ES蒸发光散射检测器，黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110781-200613)；芪黄通秘软胶囊(神威药业集团有限公司，批号1306281)；甲醇(Fisher Scientific ，色谱纯)，其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL·min-1；柱温为35℃；ELSD的漂移管温度：105℃，载气流速：2.0L·min-1。

2.2 溶液制备和进样

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，用甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备[4]取本品内容物5g，精密称定，加硅藻土10g，研匀，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流提取4h，弃去乙醚液，提出滤纸筒，待乙醚挥尽，将滤纸筒再置于索氏提取器中，加甲醇足以没过滤纸筒，冷浸过夜，再加甲醇适量，回流提取4h，回收甲醇并置水浴上蒸干。残渣加水10mL使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次30mL，弃去氢氧化钠溶液，再以正丁醇饱和水洗涤至中性，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液 按本品处方比例称取除黄芪外的其余中药适量，按照制剂工艺制成阴性对照制剂，照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法专属性考察

阴性空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μL进样。在上述色谱条件下黄芪甲苷峰与其他峰达到基线分离，阴性空白溶液没有干扰。见图1。

图1 高效液相色谱

2.4 线性试验

取0.3664mg/mL黄芪甲苷对照品溶液，依次精密吸取对照品溶液5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以进样量的常用对数(X)为横坐标，峰面积的常用对数(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得黄芪甲苷线性回归方程分别为Y=1.5193X+3.3984(r=0.999,n=5)。结果表明，黄芪甲苷含量在1.832～5.496μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 溶液稳定性

按含量测定项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12h精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。测定结果表明，供试品溶液在室温情况12h内RSD为1.28%，溶液稳定性良好。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积。测定结果RSD为0.88%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

对同一样品(批号1306281)6份，依含量测定项下供试品制备方法提取、制备、测定，结果表明，含量平均值为165.96μg/粒，RSD=0.93%，表明重复性良好。

2.8 回收率试验

采用加样回收法，称取同一批已知含量的样品(批号1306281)6份，精密加入等量黄芪甲苷对照品溶液(0.405mg/mL)，制备加样回收供试品溶液，按照上述色谱条件检测，检测结果表明，加样回收率为99.7%，RSD为1.12%，方法准确度高。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

2.9 耐用性

(1)不同柱温考察。按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于柱温33℃、35℃、37℃精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，RSD为2.0%，结果表明，柱温变化对样品的测定影响不大。

(2)不同色谱柱考察。选用菲罗门-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)、华普-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)、岛津-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)三个不同厂家的色谱柱测定峰面积。每根柱子平行测定2次。测定的结果RSD为0.86%。表明不同厂家C18柱(4.6mm×250mm,5μm)对测定结果影响较小。

3 讨论

3.1 方法选择

黄芪甲苷在近紫外区200～210nm处有末端吸收，由于黄芪所含化学成分复杂，除黄芪甲苷外还有多种皂苷、氨基酸、多糖和黄酮类成分，这些成分大多数在波长200nm附近存在吸收。直接采用紫外检测器，干扰多，灵敏度低，准确度差[5]。本实验参考黄芪注射液国家药品标准的黄芪甲苷检测方法[6]，确定采用ELSD(蒸发光散射)检测器进行检测。

3.2 提取方法确定

本实验采用黄芪甲苷易溶于甲醇、正丁醇的性质，用甲醇浸泡回流提取，正丁醇萃取，乙醚除去油类杂质，利用氢氧化钠及水洗除去其他水溶性杂质，得到较纯净的黄芪甲苷溶液。

3.3 HPLC-ELSD法优势

国家标准中芪黄通秘软胶囊中黄芪甲苷含量的测定采用薄层扫描法。该方法受薄层板铺制、色谱展开条件、显色剂配比及显色条件等多因素的影响，重复性较差。本实验采用高效液相色谱法，有效规避了原薄层扫描法操作繁琐、准确度低、耗时过长的缺点，为制订芪黄通秘软胶囊的标准提供了数据支持。

4 结论

本品含量测定方法经过方法学验证，其专属性、线性范围、溶液稳定性、精密度、重复性、准确度、耐用性等均符合要求，该方法可以用于芪黄通秘软胶囊中黄芪甲苷含量的测定。

[1] 张纲，陈浩达，孔德宪，等.芪黄通秘软胶囊中三味药材的薄层色谱鉴别[J].亚太传统医药，2011，7(4):28-29.

[2] 黄可儿，赵敏，王建华．黄芪总苷的药理研究进展[J].中药新药与临床药理，2005，16(6)：461-463.

[3] 肖崇厚．中药化学[M].上海：上海科学技术出版社,1997：387-390.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京.化学工业出版社，2010:212.

[5] 田丰，邓英杰.HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷含量[J]. 沈阳药科大学学报，2000,17(1)：17-22.

[6] 国家药典委员会.黄芪注射液质量标准[J].中国药品标准，2002,3(1)：32-34.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of Astragaloside Ⅳ in Qihuangtongmi soft Capsules by HPLC-ELSD

Duan Chungai1，Chen Zhong2，Li Fei2，Jiang Guozhi2*，Zhang Yanyan2

(1.Hebei Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Certification，Shijiazhuang 050091， China；2.Shineway Pharmaceutical Group Co.,Ltd，Shijiazhuang 051430，China)

Objective:To establish an method for determing astragaloside Ⅳ in Qihuangtongmi soft capsules. Methods:The HPLC-ELSD method was conducted on a C18column (250mm×4.6mm，5μm) with methanol:water (75: 25) as mobile phase. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min. The column temperature was at 35℃. The temperature of drift tube for measurement was 105℃ and the flow rate of air was 2.0 L·min-1. Results:The method is highly specific, the linear ranges of astragaloside Ⅳ was 1.832～5.496μg( r =0.999，n=5).The average recoveries of astragaloside Ⅳ were 99.70% with corresponding RSD of 1.12%. Conclusion:The method is sensitive, accurate with a good reproducibility and is reliable for quality control of Qihuangtongmi soft capsules.

HPLC-ELSD；Qihuangtongmi Soft Capsules；Astragaloside Ⅳ

2014-08-04

段春改(1969-)，女，河北省食品药品监督管理局药品认证审评中心高级工程师，研究方向为药品质量研究、技术审评及药事管理。

姜国志(1981-)，男，神威药业集团有限公司工程师，研究方向为药品工艺、质量研究及产业化。

R284

A

1673-2197(2015)01-0023-02

10.11954/ytctyy.201501012