外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗生长和生理特性的影响

郭经纬　商桑　穆大伟　田丽波

摘 要 研究不同浓度的外源NO供体硝普钠（sodium nitroprusside， SNP）溶液对8 ℃低温胁迫下豇豆幼苗生长和生理特性的影响，结果表明，0.5～1.5 mmol/L外源NO处理下，豇豆幼苗叶面积、根冠比、壮苗指数有所提高，脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白和叶绿素含量增加，丙二醛（MDA）含量降低。过高或过低浓度的外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗生长的缓解作用均不显著，过低浓度的外源NO会促进MDA累积。在低温胁迫下，适当浓度的外源NO能促进脯氨酸和可溶性蛋白的形成，提高叶绿素含量，降低膜脂过氧化程度，从而增强豇豆幼苗对低温胁迫的适应性。

关键词 外源NO；低温胁迫；豇豆；生长指标；生理特性

中图分类号 S643 文献标识码 A

Effects of Exogenous Nitric Oxide on Growth and Physiological

Characteristics of Asparagus Bean Deedlings Under Cold Stress

GUO Jingwei， SHANG Sang*， MU Dawei， TIAN Libo*

Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources /

College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract The effects of exogenous NO donor sodium nitroprusside（SNP）solution with different concentrations on the growth and physiology characteristics of Asparagus bean seedlings which were treated at 8 ℃ low temperature stress were studied. The results showed that the leaf area， root/shoot ratio and strong seedling index increased； the content of proline， soluble protein and chlorophyll increased and the content of MDA decreased for the 0.5～1.5 mmol/L exogenous NO treatment. The alleviating effects of exogenous NO with too high or too low concentration on the growth were not significant and the content of MDA increased when the exogenous NO concentration was too low. The exogenous NO with proper concentration could promote the formation of proline， soluble protein， improve the content of chlorophyll and decrease membrane lipid peroxidation to enhance the adaptability for low temperature stress.

Key words Exogenous NO； Low temperature stress； Asparagus bean； Physiological index； Morphological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.012

一氧化氮（nitric oxide，NO）作为植物生长发育过程中重要的活性分子，可以提高植物对非生物胁迫的抗性，并且参与多种生理过程[1-2]。已有研究结果表明，外源NO供体硝普钠（SNP）是植物新的生长调节剂，在缓解植物因低温胁迫引起的伤害中起着重要的作用[2]，还可减缓干旱胁迫、铜胁迫等逆境对作物的伤害[3-4]。黄瓜幼苗在盐胁迫下施用低浓度的外源NO可以减缓其根系的脂质过氧化程度[5]；吴锦程等[6]研究表明，外源NO处理可提高枇杷幼果过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏可血酸过氧化物酶（APX）的活性，降低枇杷幼果的膜质过氧化程度，增加渗透调节物质的含量，缓解低温胁迫对枇杷幼果的伤害；外源NO可以通过提高活性氧（ROS）、水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）活性，抑制乌头酸酶（aconitase）活性，来增强采收后的桃子果实对褐腐病菌的抗性[7]；外源NO能明显提高黄瓜幼苗叶片的净光合速率和叶绿素含量，降低膜透性和丙二醛（MDA）含量，减缓低温对黄瓜幼苗生长的抑制[8]；外源NO可缓解低温对番茄幼苗的生长抑制作用，提高其根系活力[9]。

豇豆（Vigna unguiculata L.）是豆科豇豆属豇豆种一年生缠绕草本植物，原产于非洲东北部和印度，中国是其第二起源中心[10]，在我国广泛栽培。豇豆也是海南主要冬季瓜菜之一，豇豆喜温，耐热，不耐低温，海南冬季易受内陆冷空气的影响，各地区有害积寒值从0.68 ℃·d到9.05 ℃·d不等[11]。低温胁迫降低了豇豆种子的萌发率和出芽率[12]，抑制了植株生长，导致酶活性下降[13]，15 ℃以下豇豆不易生长结荚[11]。低温对豇豆产量及品质的影响极大，常常造成巨大的经济损失[11-14]。

外源NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）可缓解低温胁迫对黄瓜、番茄、枇杷的伤害，但对低温胁迫下豇豆幼苗生长、生理特征影响的研究鲜有报道，本研究针对豇豆冬春生产中存在的低温胁迫问题，通过对豇豆幼苗根际施加外源NO，初步探讨不同浓度的外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗生长和生理特性的影响，为制定豇豆低温冷害的有效防御措施提供依据及技术支持，对提高豇豆的抗逆能力具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

以夏宝二号豇豆为试材，购于儋州市红旗市场。外源NO供体硝普钠（SNP）由上海化工公司提供。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 挑选饱满、健康的豇豆种子，温汤浸种后，播种于50孔育苗穴盘，每穴1粒。放于育苗温室培养，昼夜温度18～22 ℃，自然光照，待幼苗2叶1心时，选取整齐一致的幼苗放入光照培养箱中培养，光照强度为72 μmol/（m2·s），温度8 ℃/8 ℃（昼/夜）。

试验设6个处理：（1）8 ℃低温胁迫+蒸馏水处理（CK）；（2）8 ℃低温胁迫+0.1 mmol/L SNP；（3）8 ℃低温胁迫+0.5 mmol/L SNP；（4）8 ℃低温胁迫+1.0 mmol/L SNP；（5）8 ℃低温胁迫+1.5 mmol/L SNP；（6）8 ℃低温胁迫+2.0 mmol/L SNP。每处理重复3次，每个重复15株苗，

分别用不同浓度的SNP溶液进行根际处理，对照只浇蒸馏水，低温胁迫5 d后，取出幼苗植株，测定各项指标，生理指标测定采用完全展开的第2片真叶。

1.2.2 项目测定 用钢卷尺测量（精确到1 mm）幼苗的株高（茎基部到生长点），用游标卡尺测定茎粗、下胚轴长（胚乳节以下至根颈部分）；用电子天平称量鲜重；将鲜样置于110 ℃烘箱中杀青10 min 后调至75 ℃烘至恒重，称重；叶面积的测定：使用手持式激光叶面积仪（Laser Area Meter CI-203）对叶片直接测量；含水量=（鲜重-干重）/鲜重×100%，根冠比按地上部分和地下部分分开取鲜样，烘干后称重；壮苗指数=（茎粗/株高+地下部重/地上部重）×干重[15]。

采用茚三酮法测量脯氨酸含量[16]；采用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛的含量[17]；采用考马斯亮蓝G-250染色法对可溶性蛋白的含量进行测定[16]；每个处理随机均匀取3片叶片，每个叶片取5个不同的点，分别用叶绿素含量测定仪SPAD-502进行测量，并记录每个点测得的叶绿素含量的相对值（SPAD值）。

1.3 数据统计与分析

使用Microsoft Excel 2013进行数据统计与分析；使用DPS 7.05软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗生长的影响

表1为低温胁迫下SNP对豇豆幼苗形态指标的影响，不同浓度SNP处理对低温胁迫的缓解作用不同。0.1 mmol/L处理对株高、茎粗、叶面积、干重的影响不大，相比对照下胚轴长、含水量、根冠比及壮苗指数提高，而1.0～2.0 mmol/L SNP对株高、茎粗、下胚轴长、干重相较于对照均降低，根冠比、叶面积和壮苗指数均提高。处理0.5 mmol/L SNP的株高、茎粗和下胚轴长分别为12.07、0.27和4.87 cm，高于对照和其他处理，但差异未达显著水平。处理0.5 mmol/L SNP的叶面积最大，为17.62 cm2，极显著高于对照和其他处理，但随着施用SNP浓度的增加，豇豆幼苗的叶面积并没有持续增长。处理0.5 mmol/L SNP的根冠比和壮苗指数最大，分别为0.39和0.78，分别比对照提高了77.27%和136.36%，相对于对照及其他处理，差异达极显著。各处理间豇豆幼苗的干重和含水量与对照相比，未达显著性差异。

综上所述，不同浓度的SNP对低温胁迫下豇豆幼苗的生长影响不同，但0.5 mmol/L SNP处理可缓解低温胁迫对豇豆幼苗的生长抑制。

2.2 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗生理特性的影响

2.2.1 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗脯氨酸含量的影响 由图1可知，施用SNP可以不同程度提高低温胁迫下豇豆幼苗体内脯氨酸含量。5个处理的脯氨酸含量分别比对照处理提高了24.57%、43.10%、22.41%、9.91%、5.17%，处理0.1 mmol/L SNP、0.5 mmol/L SNP和1.0 mmol/L SNP脯氨酸含量与对照差异都达到极显著水平，处理1.5 mmol/L SNP和2.0 mmol/L SNP脯氨酸含量与对照间差异未达显著水平，由此可知，0.5 mmol/L SNP对豇豆幼苗脯氨酸含量的影响效果最佳，过高浓度的SNP会抑制豇豆幼苗脯氨酸的积累。

2.2.2 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗可溶性蛋白含量的影响 从图2可以看出，施用SNP可以提高低温胁迫下豇豆幼苗的可溶性蛋白含量，0.1、0.5、1.0 mmol/L SNP处理可溶性蛋白含量分别比对照增加了20%、40%、40%，与对照差异达显著水平。1.5、2.0 mmol/L SNP处理豇豆幼苗可溶性蛋白含量和对照无显著性差异。说明0.5 mmol/L SNP和1.0 mmol/L SNP可提高低温胁迫下豇豆幼苗可溶性蛋白含量，高浓度SNP对低温胁迫下豇豆幼苗可溶性蛋白的积累作用不大。

2.2.3 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗丙二醛含量的影响 由图3可知，0.5～2.0 mmol/L SNP处理后，豇豆MDA含量均降低。各处理中，0.5 mmol/L SNP处理的MDA含量减少了12.98%，缓解低温胁迫的效果最好，与对照差异达显著水平；1.5 mmol/L SNP处理的MDA含量减少了7.86%，2处理在不同程度上可以缓解低温胁迫对幼苗细胞膜的伤害。但0.1 mmol/L SNP处理的MDA含量提高12.60%，过低浓度的SNP不能抑制豇豆幼苗的MDA积累。

2.2.4 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗叶片中叶绿素含量的影响 从图4可知，施用SNP可以提高低温胁迫下豇豆幼苗叶片的叶绿素含量，0.1～1.0 mmol/L SNP处理均可显著缓解低温对叶的伤害，其叶绿素含量分别为37.00、39.28、37.17，分别比对照增加4.40%、10.84%、4.88%，与对照差异达显著水平。1.5 mmol/L SNP、2.0 mmol/L SNP处理叶片叶绿素含量与对照相比未达显著性差异。说明0.5 mmol/L SNP处理对低温胁迫下豇豆幼苗叶片叶绿素含量缓解效果最好。

3 讨论与结论

张瑜[18]的研究结果表明，低温胁迫下，豇豆幼苗的光合色素、可溶性糖和可溶性蛋白质等含量明显降低，MDA含量升高；樊怀福等[19]的研究结果表明，低温胁迫使黄瓜幼苗的干重、鲜重、叶绿素含量等形态指标显著下降，膜透性和MDA含量等生理指标显著增加。近年来，NO作为植物生长调节的信号分子，与植物非生物胁迫间关系受到普遍关注。

3.1 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗形态指标的影响

低温极易造成植株生长发育受阻，形态指标可以反映植株幼苗的生长状况[15]，如较大的叶面积可以增加植株的光合作用；根冠比能反映出植物地上、地下部生长发育情况，高则根系机能活性强，低则弱[20]。于秀针等[9]研究发现，施加外源NO可以增加低温下番茄幼苗的株高、茎粗、叶片数，提高鲜重、干重，1.0 mmol/L SNP处理对其生长指标影响效果最好。由本试验研究结果可知，在低温胁迫条件下，适当浓度的外源NO促进了豇豆幼苗的株高、茎粗、下胚轴长和叶面积生长，提高了豇豆含水量、干重、根冠比和壮苗指数，从叶面积、根冠比及壮苗指数几个指标来看，0.5～1.0 mmol/L处理显著高于对照。施用过高或过低浓度的外源NO会抑制豇豆幼苗的生长。外源NO对豇豆幼苗的株高、茎粗、下胚轴长、含水量、干重的影响和对照相比未达到显著水平，可能与低温胁迫时间较短有关系，在下一步的实验当中可适当延长胁迫时间。另外，对比番茄试验与本次豇豆试验可知，在低温胁迫时，外源NO可以使植物幼苗生长更加良好，说明外源NO提高了植物幼苗的抗冷性；豇豆幼苗在0.5 mmol/L时生长最好，而番茄幼苗在1.00 mmol/L时生长最好，说明因植物种类不同，缓解低温胁迫的最适外源NO浓度也不一致，因此不同植物利用外源NO降低低温胁迫的影响时，需要进行前期实验。

3.2 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

植物在低温胁迫下，脯氨酸和可溶性蛋白是重要的渗透调节物质，作为防脱水剂保护植物，其含量增加，可增强细胞或组织的持水能力，对生物膜起到保护作用，增强植物抗寒性[21]。杨美森等[20]研究发现，经SNP处理的棉花幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量的上升可以增强棉花幼苗的抗冷性。本研究结果发现，SNP可以提高低温胁迫下豇豆幼苗的Pro和可溶性蛋白含量，0.5 mmol/L SNP处理豇豆幼苗的Pro和可溶性蛋白含量最高，表明Pro和可溶性蛋白质含量增加，细胞的渗透势得到调节，提高了豇豆幼苗的耐冷性。

3.3 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗丙二醛含量的影响

丙二醛（malondialdehyde）是膜脂过氧化作用的主要产物之一，常作为质膜过氧化作用的主要指标，低温胁迫可引发或加剧细胞的膜脂过氧化作用，植物抗寒性与MDA含量呈负相关[22]。吴锦程等[6]研究认为，低温胁迫可引发或加剧枇杷幼果细胞膜脂过氧化作用，致使MDA含量增加，SNP处理能有效降低低温胁迫下枇杷幼果的MDA含量，缓解低温胁迫对枇杷幼果的膜脂过氧化损伤程度。本研究结果表明，SNP处理可以抑制低温胁迫下豇豆幼苗MDA的产生，缓解冷害胁迫下膜质过氧化作用对细胞的伤害。

3.4 外源NO对低温胁迫下豇豆幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素（chlorophyll）是一类与光合作用（photosynthesis）有关的最重要的色素，在光合作用中起着吸收、传递和转化光能的重要作用[23]。低温胁迫下，植物叶绿体类囊体膜的膜质组分和膜蛋白发生改变，类囊体的超微结构受到破坏，引起膜质的过氧化，光合速率下降[24-25]。吴锦程等[6]、杨美森等[20]研究结果表明，喷施SNP能提高低温胁迫下植株叶片的叶绿素含量，这与本试验的研究结果一致。这可能是因为低温胁迫下，叶绿体结构破损，合成叶绿素含量减少，而SNP具有强氧化性的活性氮，能够促进叶绿体结构的修复，提高叶绿素的含量，因而提高豇豆幼苗抗冷害能力[26]。

综上所述，在低温胁迫下，外源NO可以增加豇豆株高、茎粗、叶面积、壮苗指数和豇豆生物量，并能够提高豇豆幼苗Pro、可溶性蛋白和叶绿素含量，降低丙二醛含量，从而增强豇豆幼苗对低温胁迫的适应性。

参考文献

[1] Besson-Bard A， Pugin A， Wendehenne D. New insights into nitric oxide signaling in plants[J]. Annu Rev Plant Biol， 2008， 59： 21-39.

[2] Siddiqui M H， Al-Whaibi M H， Basalah M O. Role of nitric oxide in tolerance of plants to abiotic stress[J]. Protoplasma， 2011， 248（3）： 447-455.

[3] Garcia-Mata C， Lamattina L. Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress[J]. Plant Physiology， 2001， 126（3）： 1 196-1 204.

[4] Hu K D， Hu L Y， Li Y H， et al. Protective roles of nitric oxide on germination and antioxidant metabolism in wheat seeds under copper stress[J]. Plant Growth Regulation， 2007， 53（3）： 173-183.

[5] Shi Q， Ding F， Wang X， et al. Exogenous nitric oxide protect cucumber roots against oxidative stress induced by salt stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2007， 45（8）： 542-550.

[6] 吴锦程， 陈伟建， 蔡丽琴， 等. 外源NO对低温胁迫下枇杷幼果抗氧化能力的影响[J]. 林业科学， 2010， 46（9）： 73-78.

[7] Shi J Y， Liu N， Gu R X， et al. Signals induced by exogenous nitric oxide and their role in controlling brown rot disease caused by Monilinia fructicola in postharvest peach fruit[J]. Journal of General Plant Pathology， 2015， 81（1）： 68-76.

[8] 徐洪雷， 于广建. 一氧化氮NO对黄瓜低温胁迫的缓解作用[J]. 东北农业大学学报， 2007， 38（5）： 606-608.

[9] 于秀针， 张彩虹， 姜鲁艳， 等. 外源NO对低温胁迫下番茄种子萌发和幼苗生长的影响[J]. 北方园艺， 2014（22）： 5-8.

[10] 吕家龙主编. 蔬菜栽培学各论[M]. 北京： 中国农业出版社， 1980.

[11] 张 蕾， 霍治国， 黄大鹏， 等. 海南冬季主要瓜菜寒害风险区划[J]. 中国生态农业学报， 2014， 22（10）： 1 240-1 251.

[12] 张献英， 唐力生， 犹昌艳， 等. 低温对豇豆种子萌发和出苗的影响[J]. 南方农业学报， 2013， 44（11）： 1 785-1 790.

[13] 彭永康， 郝泅城， 王振英. 低温处理对豇豆幼苗生长和POD、COD、 ATPase同工酶的影响[J]. 华北农学报， 1994， 9（2）： 76-80.

[14] 梁伟红， 罗 微， 刘燕群， 等. 海南冬季瓜菜产业风险及可持续发展对策研究[J]. 江苏农业科学， 2013， 41（10）： 431-433.

[15] 别之龙， 黄丹枫， 等. 工厂化育苗原理与技术[M]. 北京： 中国农业出版社， 2008.

[16] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

[17] 张志良. 植物生理实验指导[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

[18] 张 瑜. 环境因子对豇豆光合特性和若干生理生化指标的影响[D]. 福州： 福建农林大学园艺学院， 2010.

[19] 樊怀福， 杜长霞， 朱祝军. 外源NO对低温胁迫下黄瓜幼苗生长、 叶片膜脂过氧化和光合作用的影响[J]. 浙江农业学报， 2011， 23（3）： 538-542.

[20] 杨美森， 王雅芳， 干秀霞， 等. 外源一氧化氮对冷害胁迫下棉花幼苗生长、 抗氧化系统和光合特性的影响[J]. 中国农业科学， 2012， 45（15）： 3 058-3 067.

[21] 冯兆忠， 王 静， 冯宗炜. 三哇酮对黄瓜幼苗生长及抗寒性的影响[J]. 应用生态学报， 2003， 14（10）： 1 637-1 640.

[22] 刘祖祺， 张石城. 植物抗性生理学[M]. 北京： 中国农业出版社， 1994.

[23] Li X G， Meng Q W， Jiang G Q， et al. The susceptibility of cucumber and sweet pepper to chilling under low irradiance is related to energy dissipation and water-water cycle[J]. Photosynthetica， 2003， 41（2）： 259-265.

[24] 许 楠， 孙广玉. 低温锻炼后桑树幼苗光合作用和抗氧化酶对冷胁迫的响应[J]. 应用生态学报， 2009， 20（4）： 761-766.

[25] Taylor A O， Craig A S. Plants under climatic stress II. Low temperature， high light effects on chloroplast ultrastructure[J]. Plant physiology， 1971， 47（5）： 719-725.

[26] 敬 岩， 孙宝腾， 符建荣. 一氧化氮改善铁胁迫玉米光合组织结构及其活性[J]. 植物营养与肥料学报， 2007， 13（5）： 809-815.