南瓜种质资源遗传多样性的SRAP分析

卢丽芳　朱海生　温庆放　林义章

摘 要 本研究应用SRAP分子标记技术对所收集的85份南瓜资源进行亲缘关系分析，从100对引物中挑出17对引物对其进行条带扩增。结果表明：共获得条带200条，差异带有187条，13条条带为所有南瓜品种所共有，多态性比例为93.5%。基于SRAP数据通过Ntsys2.10e软件计算出85份南瓜资源的遗传相似系数在0.450 0～0.985 0。通过聚类分析将所收集的南瓜资源分为3大类：中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，亲缘关系较近的是中国南瓜与美洲南瓜，二者与印度南瓜的亲缘关系较远。

关键词 南瓜；SRAP；亲缘关系；聚类分析

中图分类号 S642.1 文献标识码 A

Analysis of Genetic Diversity in Squash by SRAP Markers

LU Lifang1，ZHU Haisheng2，3，4*，WEN Qingfang2，3，4*，LIN Yizhang1

1 College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China

2 Crops Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China

3 Vegetable Research Center，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China

4 Fujian Engineering Research Center for Vegetables，Fuzhou，Fujian 350013，China

Abstract In this study，SRAP was used to analyse the genetic relationship of 85 accessions in squash. Seventeen pairs of primers were screened out of 100 primer pairs which produced 200 DNA bands， with 187 bands of polymorphic and 13 bands for all squash. The ratio of polymorphic bands was 93.5%. Based on the SRAP data，the genetic similarity coefficient of 85 accessions in squash was between 0.450 0 to 0.985 0， which was calculated by Ntsys2. 10e. Through cluster analysis，Squashes were divided into three groups：Cucurbita moschata，C. maxima，C. pepo. The relationship of C. moschata and C. pepo were close，the kinship with the C. maxima was far.

Key words Squash；SRAP；Genetic relationship；Cluster analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.006

南瓜属（Cucurbita L）葫芦科南瓜属的一年生草本植物，起源于美洲，在16世纪中叶明中期传入中国[1]。南瓜全球目前栽培种主要有5个：分别是中国南瓜，印度南瓜，美洲南瓜，灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中国主要是栽培前3种。南瓜是人类最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就开始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中国南瓜和墨西哥南瓜的残片存在[2]。据统计，中国已经入库保存的南瓜份数总共有1 813份，其中中国南瓜1 064份，印度南瓜357份，美洲南瓜389份，黑籽南瓜占3份[3]。由于地区间相互引种、种子公司自繁自育、农民自繁自育，导致市场上南瓜品种的名称众多，同名异物或同物异名的情况频繁出现，给南瓜种质资源的收集工作和南瓜的育种工作造成困难。因此对于育种工作者来说，种质资源收集完成后，通过对收集的资源进行系统的评价分析，才能够更加明确需要选择的育种亲本，实现相应的育种目标。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）又称为相关序列扩增多态性，2001年由美国加州蔬菜作物系的Li等[4]发明的，是一种基于PCR反应的新型标记系统，具有多态性高、样品信息量大、操作简便、重复稳定、可靠性高、费用低、非等位检测的优点[5]。其原理是通过对富含GC碱基的外显子和富含AT的内含子及启动子的ORF（开放式阅读框）设计一对独特的引物进行特异性扩增，从而表现出多态性[6]。为了从分子水平上了解南瓜种质资源的遗传多样性，人们已经用RAPD[7-11]、ISSR[10-11]、AELP[12]对遗传多样性进行分析。关于利用SRAP分子标记对南瓜种质资源遗传多样性进行研究的报道较少，刘小俊等[13]利用SRAP对收集的76份南瓜资源进行遗传多样性分析。本研究在广泛收集南瓜种质资源、优化南瓜SRAP扩增体系的基础上[14]，对所收集到的85份南瓜种质资源进行遗传多样性分析，建立遗传聚类图，鉴定品种间的亲缘关系，为南瓜种质资源的鉴定、分类和南瓜的育种工作提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料共85份，见表1。包括中国南瓜，印度南瓜和美洲南瓜3个栽培种。材料来源于全国各地。

1.2 方法

1.2.1 供试南瓜DNA的提取 参考卢丽芳等[14]的方法。

1.2.2 PCR反应及电泳 反应在PCR仪上进行，扩增反应体系为20 uL，其中包括0.2 mmol/L dNTP，1.5 U Taq酶，80 ng DNA，0.16 umol/L的单条引物，1.5 mmol/L的Mg2+，2 uL 10×Buffer。扩增程序：94 ℃ 5 min预变性；接着进入5个循环，包括94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；然后进入35个循环，包括94 ℃ 1 min，52 ℃ 1min，72 ℃ 1 min；最后72 ℃延伸10 min。将扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳缓冲液为1×TBE，采用DL 2 000 DNA Marker作为标准分子量对照，电泳时间45 min。电泳完成后，在EB中染色10 min左右，放入到凝胶成像分析系统中观察、拍照。

1.2.3 数据统计 根据所获得的电泳图进行数据的统计和处理。电泳图中的每一条带代表着模板DNA和引物之间的一个结合位点，根据DNA扩增结果，进行人工计数，统计不同品种之间有重复性的多态性扩增条带，有条带的记为1，没有条带的则记为0，从而形成由0和1组成的原始矩阵。采用Ntsys2.10e软件进行数据处理，获得相应的相似系数表和树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

通过选用外观形状差异较大的5个南瓜品种对100对引物进行筛选，选出13条引物（表2）将其用于南瓜SRAP分析，其中上游引物6条，下游引物7条。组成17对多态性高、重复性好、条带清晰的SRAP引物，以此对85份南瓜材料进行SRAP遗传多样性分析，结果见表3。

2.2 17对引物的SRAP扩增结果

由表3可知，17对引物共扩增出条带200条，平均每个引物扩增出条带11.76条，其中差异带有187条，13条条带为所有南瓜品种所共有，多态性比例为93.5%。其中ME7EM1组合扩增条带数最多，达到17条，多态性为100%，见图1。ME6EM9扩增条带数最少，为8条，差异带有7条，多态性为87.5%。17对引物扩增条带的多态性，最高为100%，最低为77.78%。结果表明，南瓜种质资源的遗传多样性很高，同时也表明了SRAP分子标记能够很好地检测南瓜种质资源的遗传多样性。

由表4可知，3个栽培种的种内多态性高低顺序为：印度南瓜>中国南瓜>美洲南瓜，分别为51.5%、 45%、31.5%。而种间两两多态性为：中国-印度南瓜为78.5%，中国-美洲南瓜为76%，印度-美洲南瓜为81.5%。

2.3 85份南瓜聚类结果

基于SRAP数据通过Ntsys2.10e软件计算出85南瓜资源的遗传相似系数。85份南瓜遗传相似系数在0.450 0～0.985 0，平均为0.7155。其中材料10与材料83的遗传相似系数最小（为0.450 0），说明材料10与材料83的亲缘关系最远。材料52与材料54的遗传相似系数最大（为0.985 0），说明材料52与材料54的亲缘关系最近。

采用Ntsys2.10e软件对85份南瓜资源亲缘关系进行SRAP分析。根据图2可知，在遗传相似系数为0.616 0处，可将南瓜分为3大类，分别是中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜。亲缘关系较近的是中国南瓜与美洲南瓜，2类南瓜与印度南瓜的亲缘关系较远。

第一类：中国南瓜（41份），包括密本南瓜特别种（1）、原种密本南瓜（2）、夷香密本（4）、密本南瓜（5）、密本南瓜（3）、密本南瓜（6）三明圆南瓜（26）、密本2号（11）、本地南瓜子（33）、大金钩南瓜（14）、永定南瓜1号（28）、永定南瓜2号（29）、青丰金钩南瓜（15）、无蔓一号（19）、新无蔓一号（20）、武夷山南瓜本地种3号（32）、庐丰安3（34）、密本南瓜（7）、密本南瓜（8）、密本南瓜王（9）、南瓜子（37）、无蔓一号（64）、金勾南瓜（49）、五月早南瓜（47）、 金密南瓜（48）、一串铃一号南瓜（51）、金钩南瓜（13）、三明长南瓜（27）、武夷山南瓜本地种2号（30）、武夷山南瓜本地种1号（31）、黑密南瓜（57）、世龙金密南瓜（63）、圆形种（36）、密本南瓜（12）、江西农家种（25）、庭院南瓜（16）、星早南瓜（17）、中夏南瓜1号（60）、中夏南瓜2号（61）、一串铃1号南瓜（花皮）（44）、蜜枣南瓜（998）（45）。

第二类：美洲南瓜（17份），有晶珠早南瓜（70）、美国绿丹（71）、西葫芦早青一代（74）、新早青一代（75）、湘葫一号（76）、雪玉（85）、西葫芦（77）、满田雅绿（84）、金珠（82）、碧珠（78）、京珠（79）、京香蕉（80）、金榜（81）、京葫一号（83）、长型南瓜（35）、晶莹翠（72）、改良早青一代（73）。

第三类：印度南瓜（27份），有日本南瓜（23）、甜面大南瓜（46）、日本红栗（40）、短蔓红栗（42）、密本南瓜（10）、巨型南瓜（18）短蔓红（21）、短蔓红（22）、进口红栗（41）、日本甜栗（38）、日本甜栗（39）、 日本南瓜（24）、 胜栗（52）、 君川金栗（54）、谢花面南瓜（56）、 黑蜜宝（53）、 黑冠军（55）、 绿皮南瓜F1（62）、 李白（65）、 早熟京绿栗（66）、 红板栗（67）、 韩香栗（68）、 迷你贝贝（58）、 台友红南瓜（59）、 短蔓京绿栗（43）、 红栗南瓜（50）、 京银栗南瓜（69）。

3 讨论与结论

SRAP分子标记在蔬菜[15-17]、花卉[18]、果树[19]的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析上应用广泛，在南瓜上应用不多。仅刘小俊等[13]利用SRAP分子对南瓜种质资源遗传多样性进行分析，结果表明SRAP分子标记将76份南瓜材料分为3大类，分别是中国南瓜、美洲南瓜和印度南瓜。刘小俊等[8]应用RAPD分子标记对30份在中国栽培的南瓜进行遗传多样性分析，分类结果与其应用SRAP标记获得的分类结果一致。李俊丽等[9]对70份南瓜的遗传多样性进行RAPD分析，结果将其分为3类，分别是中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，认为亲缘关系最近的是中国南瓜和美洲南瓜，但2类南瓜与印度南瓜的关系较远。张天明[12]对4个南瓜属栽培种进行AFLP分析，聚类结果能够将4个栽培种分开，且美洲南瓜与黑籽南瓜关系较近，两者与中国南瓜的亲缘关系稍远，三者与印度南瓜的关系最远。赵福宽等[7]应用RAPD分子标记对76份南瓜进行亲缘关系分析，分类结果与刘小俊等[13]、李俊丽等[9]的分类结果一致，并认为中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜3个栽培种的种间差异明显。此外，肖祖梅[10]应用RAPD和ISSR分子标记对观赏南瓜进行遗传多样性分析，杨正安等[11]应用ISSR和RAPD分子标记对云南黑籽南瓜进行亲缘关系分析。除了应用分子标记对南瓜的亲缘关系和遗传多样性进行分析外，形态学标记、细胞学标记和同工酶标记在南瓜上也有应用，如李俊丽[20]对70份南瓜资源的45个植物学性状进行鉴定，通过聚类，将70份南瓜分为3大类群，分别是中国南瓜、美洲南瓜和印度南瓜，且美洲南瓜与中国南瓜的亲缘关系最近，印度南瓜与中国南瓜、美洲南瓜与印度南瓜的关系稍远。巴林[21]对南瓜F1代杂种的一价染色体和细胞二价染色体进行比较，认为中国南瓜和美洲南瓜的亲缘关系最近，与印度南瓜的关系次之。孙正海等[22]对中国南瓜、美洲南瓜、印度南瓜的41个品种进行过氧化物同工酶分析，聚类分析表明中国南瓜和美洲南瓜亲缘关系近，两者与印度南瓜的关系较远。

本研究对100对SRAP引物进行筛选，挑出17对引物进行扩增，获得扩增条带200条，其中差异带187条，多态性比例为93.5%，表明所收集的南瓜种质资源的遗传基础范围较广。从种间差异来看，印度-美洲南瓜>中国-印度南瓜>中国-美洲南瓜。从种内差异来看，印度南瓜>中国南瓜>美洲南瓜，这一结果与孙正海等[22]对中国南瓜、美洲南瓜、印度南瓜的41个品种进行过氧化物同工酶分析获得的结果不一致，孙正海等[22]认为中国南瓜种内差异最大，印度南瓜种内差异最小。通过聚类分析，将收集的85份南瓜分为3大类，分别是中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，亲缘关系较近的是中国南瓜和美洲南瓜，它们与印度南瓜的亲缘关系则较远。分类结果与刘小俊[8、13]、李俊丽[9]、张天明[12]、赵福宽等[7]应用RAPD、SRAP、AFLP分子标记技术得到的结果一致，与形态学标记、细胞学标记和同工酶标记获得的结果也一致。

由于市场上南瓜品种名称众多，同名异物或异物同名的现象严重，加上地区间的引种频繁，对育种工作造成困难。如本研究中，10号材料在种质资源收集时，将其归类为中国南瓜，实验后，根据聚类树状图，发现其属于印度南瓜，通过对其田间植株形态、果实外观特征进行观察鉴定，确定其为印度南瓜。印度南瓜类群中，52号胜栗与54号君川金栗2个品种名称不同，但两者间的遗传相似系数达到0.985 0，认为二者是同一个品种，即同物异名。中国南瓜类群中，1～9号材料、11号材料、12号材料均命名为密本类南瓜，但相互间的遗传相似系数存在差异，如1号材料与2号材料间遗传相似系数最大为0.9800。1号与9号、12号，2号与9号、12号，3号与12号，4号与12号，5号与12号，6号与12号，9号与11号，11号与12号，这些材料间的遗传相似系数均小于0.900，表明11个密本类南瓜中并非都是密本南瓜，存在同名异物现象。

本研究通过SRAP分子标记，揭示了南瓜种质资源的遗传多样性，掌握了不同南瓜栽培种间的遗传多态性和种内多态性的情况，对所收集的南瓜进行分类，建立了遗传聚类图，鉴定了品种间的亲缘关系，为南瓜亲本的选配和品种选育提供了理论依据

参考文献

[1] 张 箭. 南瓜发展传播史初探[J]. 烟台大学学报（哲学社会科学版）， 2010， 23（1）： 100-108.

[2] 林德佩.南瓜植物的起源和分类[J]. 中国西瓜甜瓜， 2000（1）： 36-38.

[3] 戚春章， 胡是麟， 漆小泉. 中国蔬菜种质资源的种类及分布[J]. 作物品种资源， 1997（1）： 2.

[4] Li G， Quiros C F. Sequence- related amplified polymorphism（SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103： 455-461.

[5] 史倩倩， 王 雁， 周 琳， 等. SRAP分子标记在园林植物遗传育种中的应用[J]. 生物技术通报， 2011（11）： 75-78.

[6]王晓菡， 郭先锋， 孙宪芝， 等. SRAP标记在园艺植物研究中的应用[J]. 山东农业大学学报（自然科学版）， 2009， 40（4）： 650-654.

[7]赵福宽， 李海英， 赵晓萌. 南瓜种质资源亲缘关系的RAPD分析[J]. 分析分子植物育种， 2006， 4（3S）： 45-50.

[8] 刘小俊， 李跃建， 赵 云， 等. 中国部分栽培南瓜种质资源遗传多态性RAPD分析[J]. 西南农业学报， 2004， 17（5）： 567-571.

[9]李俊丽， 向长萍， 张宏荣， 等. 南瓜种质资源遗传多 样性的RAPD分析[J]. 园艺学报， 2005， 32（5）： 834 -839.

[10]肖祖梅. 观赏南瓜种质资源遗传多样性的RAPD和ISSR分析[D]. 重庆： 西南大学， 2008.

[11] 杨正安， 孟平红， 代 贤. 云南黑籽南瓜种质遗传多样性的RAPD和ISSR分析[J]. 植物遗传资源学报， 2011， 12（6）： 860-864.

[12] 张天明. 南瓜种质资源遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析[D]. 北京： 中国农业科学院， 2005.

[13] 刘小俊， 李跃建， 梁根云， 等. 南瓜资源遗传多样性的SRAP分析[J]. 四川大学学报（自然科学版）， 2010， 47（5）： 1 195-1 200.

[14] 卢丽芳， 朱海生， 温庆放， 等. 南瓜SRAP反应体系的建立与优化[J]. 福建农业学报， 2014， 29（1）： 44-46.

[15] 崔竣杰， 宋建文， 汪国平， 等. 丝瓜种质资源亲缘关系的SRAP分析[J]. 植物遗传资源学报， 2012， 13（6）： 1 061-1 066.

[16] 周坤华， 张长远， 罗剑宁， 等. 苦瓜种质资源遗传多样性的SRAP分析[J]. 广东农业科学， 2013（2l）： 136-140.

[17] 李永平， 康建坂， 林 珲， 等. 10个佛手瓜栽培品种亲缘关系的SRAP分析[J]. 福建农林大学学报（自然科学版）， 2012， 41（6）： 590-594.

[18]智 丽， 滕中华， 李先源， 等. 23种野生百合遗传关系的SRAP分析[J]. 农业生物技术学报， 2011， 19（4）： 677-684.

[19] 刘 忠， 李 俊， 杨武云， 等. 利用SRAP分析岷江下游荔枝资源的遗传多样性与亲缘关系[J]. 西南农业学报， 2013， 26（3）： 1 152-1 159.

[20]李俊丽. 南瓜种质资源遗传多样性与多糖多样性的研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2006： 9-64.

[21] 巴 林. 中国蔬菜栽培学[M]. 北京： 农业出版社， 1987： 567-571.

[22] 孙正海， 李跃建， 宋 明， 等. 南瓜属三个种种质的遗传多样性[J]. 西南农业学报， 2004， 17（1）： 71-73.