78份杧果种质资源AFLP分析

罗海燕　应东山　黄建峰　彭素娜　洪继旺　王明　陈业渊

摘 要 利用AFLP标记技术对78份杧果种质进行遗传多样性分析，结果显示，9对AFLP引物共产生908个等位位点，平均每对引物产生100.89个等位位点，多态性带为794条，共产生42个特异性位点，能区分21份种质，单态带25条，缺失带17条，特异性条带比例为4.63%，多态性比例为87.44%。不同种质间的相似系数范围是0.603～0.913，平均相似系数为0.735。聚类分析结果显示，以遗传相似性系数0.726为阈值，供试的78份种质可分成5个类群。主成分分析结果将供试的78份种质可分成4个类群，通过空间距离更能直观地表现种质间关系远近。

关键词 杧果；AFLP；种质资源；遗传多样性

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

AFLP Analysis of the Genetic Diversity of

78 Mango Germplasms Resources

LUO Haiyan1， YING Dongshan1， HUANG Jianfeng1， PENG Suna2，

HONG Jiwang1， WANG Ming1， CHEN Yeyuan1 *

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory

of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract 78 mango accessions were studied for the analysis of genetic verity by AFLP molecular marker. The results indicated that the 78 accessions could be separated by 9 primer combinations. The primers amplified 908 reproducible fragments with an average of 100.89 and 794 bands were polymorphic in nature. A total of 42 specific sites were detected with the ratio of 4.63%， including 25 mono bands， 17 missing bands. It meant that the specific bands could separate 21 from the 78 accessions. Polymorphism ratio was 87.44%. GSC among the 78 accessions ranged from 0.603 to 0.913 with an average of 0.735. When GSC 0.726 as the threshold， the 78 mango accessions were clustered into five major groups by unweighted pair-group method with arithmetic averages. Principal component analysis results showed that the 78 mango accessions could be divided into four groups. The intuitive performance of these materials relationship could be visually shown by spatial distance.

Key words Mango； AFLP； Germplasm resource； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.004

杧果（Mangifera indica L.）为漆树科（Anacardiaceae）杧果属（Mangifera）植物，有“热带果王”之美誉，世界五大名果之一[1-4]。由于杧果从起源到驯化的过程复杂、不同地区之间相互引种等原因，导致近年来中国各地从事杧果种质资源研究的科研工作者在种质资源调查和收集研究时存在混乱，给杧果种质资源的保存和管理带来不便。目前，国内外利用分子标记手段对杧果种质遗传多样性进行了不少研究。张欣[5]应用RAPD技术对10个杧果品种的遗传变异程度研究的结果表明，RAPD组与品种对炭疽病的抗性有明显相关性。王家保等[6-7]优化了ISSR反应体系，并利用ISSR技术分析了38个杧果品种的亲缘关系。何新华等[8]利用ISSR技术鉴定7个吕宋杧品种（系）和柳州吕宋杧，表明ISSR技术对杧果品种（系）的鉴定非常有效，能区分亲缘关系很近的杧果品种（系）。张宇[9]采用ISSR分子标记技术对杧果实生苗亲本鉴定，并对不同颜色类群杧果进行遗传多样性分析。黄丽芳等[10]利用18对SSR引物对杧果遗传多样性进行分析，结果表明，109份杧果实生材料具有丰富的遗传多样性。房经贵等[11-12]利用AFLP技术进行了品种鉴定和F1亲子分离方式的研究。雷新涛等[13-14]利用AFLP分子标记对中国广西百色那坡县野生杧果资源进行了初步描述和研究，并分析了中国主要杧果品种的遗传多样性。Khalil Kashkush等[15]利用AFLP技术对16个杧果品种和7个砧木品种进行了亲缘关系分析和品种区分，并进行了杧果遗传连锁图谱的构建。Naoki Yamanaka等[16]利用AFLP技术进行遗传多样性分析，其研究结果表明，基于AFLP分析4种杧果的亲缘关系与经典分类方法相一致。国内对不同主产区的地方特色杧果资源进行遗传多样性分析尚未见报道，因此，本研究利用AFLP技术对中国不同主产区的78份地方杧果种质资源进行遗传多样性及主成分分析，旨在为进一步构建杧果种质指纹图谱、开展种质资源利用及分子标记辅助育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试78份种质（表1）取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部儋州杧果种质圃、广西亚热带作物研究所杧果种质圃、云南农科院热带亚热带经济作物研究所杧果种质圃。

1.2 方法

DNA模板的制备采用改进的CTAB法[17]，样品DNA经EcoRⅠ和MseⅠ双酶切后，与EcoRⅠ和MseⅠ特定接头连接，再进行预扩增，其反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，25个循环；72 ℃ 10 min。预扩增产物稀释30倍后采用AFLP引物（表2）进行选择性扩增，其反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，以后每轮循环退火温度递减0.7 ℃，72 ℃ 1 min，12个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28个循环；72 ℃ 10 min。选择性扩增产物中加入3 μL变性剂，充分混合，95 ℃变性5 min后用6%聚丙烯酰胺变性胶电泳对PCR扩增产物进行电泳分离，并采用印染法染色检测。AFLP引物序列合成由上海invitrogen公司合成。

1.3 数据处理

选择重复性好、清晰可辨的照片进行谱带统计，依据AFLP扩增图谱中同一位置上电泳条带的有无统计建立二元矩阵表，每个引物的迁移率相同的条带记为1个位点，有条带的赋值为1，无条带的赋值为0，构建AFLP的0、1数据库。

按照Nei和Li[18]的方法计算材料间相似系数，并利用GS值按类平均法（Unweighted pair-group method using arithmetic average，简称UPGMA）进行遗传相似性聚类分析和构建聚类图。应用NTSYSpc-2.10版软件，计算78份杧果种质间遗传距离或遗传相似系数，然后根据非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建亲缘关系聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 AFLP扩增结果

本试验从64个引物组合中选出多态性好、条带清晰的9对引物对78份杧果种质进行选择性扩增，共扩增出908条清晰谱带，多态性带为794条，特异性单态带25个，多态性比例为87.44%，特异性单态带的比例为2.75%。其中引物对M6E1产生的带最多，为118条；引物对M2E3最少，为75条，每对引物组合平均扩增带数为100.89条。另外不同的引物组合在扩增带型、扩增带数量、条带分布均匀度、多态性检出率等方面存在差异，如本实验中多态性比例最高的组合是M1E3，所占比例为97.59%；多态性比例最低的组合是M3E1，比例为82.18%；扩增出特异性条带最多的组合是M3E4、M6E4，各5条；扩增出特异性条带最少的组合是M1E3，但是该引物具有丰富的多态性。从不同引物中筛选出检测位点较多、分布均匀、清晰可变且多态性位点比例较高的引物组合提高了AFLP的试验研究效率。AFLP引物组合扩增结果见表3，引物组合M1E3扩增结果见图1。

2.2 AFLP聚类分析

对78份杧果种质进行AFLP聚类分析的结果见图2、图3。以遗传相似性系数0.726为阈值，供试的78份杧果种质可分为5个类群：

第Ⅰ类以遗传相似性系数0.76为阈值，第Ⅰ类包含的58份种质又可分为10小组：第1组有20份种质，主要采集于海南，包括大甜香杧、东镇红杧、粤西1号、湛江吕宋杧、象牙杧22号、大三年、田阳香杧、关刀杧、兴热2号、枋红杧、文昌白玉、大白玉、云南小菲、金百花、攀西红杧、五公祠、兴热1号、河口本地土杧、大核杧、二年杧；第2组有2份种质，包括柳州吕宋杧、龙杧；第3组有2份种质包括杨杧、台农1号；第4组有14份种质包括椰香杧、红桃杧、马切苏、苹果杧、龙眼香杧、鹰嘴杧、白象牙、红晕杧、秋杧、金煌杧、台芽杧、四季杧、云南小杧、东坡香杧；第5组仅有1份种质为黄象牙杧；第6组有2份种质包括生食杧、吕宋杧；第7组有8份种质包括桂热杧78-1号、桂热杧80-17号、桂热杧23号、红玉杧、紫花杧、金穗杧、红苹杧、桂香杧，主要采集于广西；第8组仅有1份种质为龙井大杧；第9组有7份种质包括球杧、云霞杧、元江象牙杧、红光6号、三年杧、三蜜杧、勐底1号，主要采集于云南；第10组仅有1份种质矮杧。

第Ⅱ类仅有1份种质虎豹牙；第Ⅲ类有3份种质包括扁桃杧、乳杧、冬杧；第Ⅳ类有15份种质包括夏茅香杧、红花本地杧、硕帅杧、海豹杧、黄玉杧、红象牙杧、安宁红杧、桂热杧10号、桂热杧3号、桂热杧82号、桂热杧120号、桂热杧60号、桂热杧71号、桂热杧7号、龙州泰国杧，主要采集于广西；第Ⅴ类仅有1份种质桂热杧284号。

遗传相似性系数越大，表明亲缘关系越近，反之越远。通过NTSYS2.1软件上对78份杧果种质进行种质间的亲缘关系分析，通过计算其遗传相似系数范围GSC为0.603～0.913，平均相似系数为0.735。在试验材料中桂热杧82号与桂热杧120号之间的相似系数最大0.913，说明二者遗传差异最小，亲缘关系最近。而柳州吕宋杧与桂热杧60号之间的相似系数最小0.603，说明二者遗传差异最大，亲缘关系最远。

2.3 AFLP主成分分析

结果见图4所示，图4中材料分布的位置关系代表材料之间的亲缘关系，将位置靠近的材料归为一类，可分为4个主要类群。其中桂热杧71号、桂热杧3号、桂热杧10号、桂热杧120号、桂热杧82号、桂热杧60号等聚在一个类群，主要来自广西；桂热杧71号的亲本是白象牙；桂热杧3号、桂热杧10号、桂热杧120号的亲本为黄象牙；桂热杧82号、桂热杧60号的亲本是印度901；来自云南的云南小菲、河口本地土杧、元江象牙杧、三年杧等聚在一个类群；来自台湾的种质金煌杧、台芽杧、台农1号聚在一个类群。结果表明，主成分分析结果与聚类分析结果基本上一致，同一地区的材料基本上聚在一起，研究还发现子一代在图中聚为一类，而亲本聚为另一类，亲子亲缘关系在图中表现淡化。亲子系中：桂热杧82号、桂热杧60号的亲本是秋杧；桂热杧3号、桂热杧10号、桂热杧120号的亲本是黄象牙；桂热杧71号亲本是白象牙，却分别聚为不同的2类。其可能原因是通过常规杂交授粉选育的材料，亲子关系的继承在图中表现较为靠近，而采用从实生变异的方式选育出的材料，亲子关系的继承表现较远，而其子代之间的亲缘关系表现较近，或者可能因为开放授粉使其遗传组成偏向另一亲本。通过常规杂交育种的桂热杧78-1号是印度杧903号和斯里兰卡811号的杂交后代，桂热杧80-17号是印度杧901号与斯里兰卡811号的杂交后代，桂热杧78-1号、桂热杧80-17号这两者靠的较近。桂热杧82号、桂热杧120号在聚类图中几乎无法区别，而在主成分分析图中表现出一定位置上的差异，从而显示出主成分分析结果能更直观地表现不同杧果种质之间关系的远近。

3 讨论与结论

前人研究结果表明，AFLP分子标记技术用于杧果系统进化分析是行之有效的方法[11-21]，并且比SSR技术更能全面、准确阐明杧果遗传多样性和亲缘关系[22]。本研究利用所筛选出的9对AFLP引物组合对78份杧果供试种质进行AFLP分析，聚类结果可将78份种质分为5大类，聚类结果与材料的地域来源比较密切，来自相同地区的材料基本聚在一起，其GSC为0.603～0.913。本研究结果表明，AFLP分子标记能充分体现品种间的亲缘关系，如桂热杧71号、象牙杧22号、海豹杧、五公祠杧为白象牙实生选育后代，他们间的GSC值均较大，分别为0.665 3、0.738 7、0.720 7、0.786 9；金煌杧是白象牙杧与凯特杧杂交后代，其与白象牙杧的GSC为0.754 9；桂热杧10号、桂热杧3号、桂热杧120号、桂热杧7号同为黄象牙杧实选后代，故同聚在第Ⅳ类；红光6号是黄象牙杧与太太杧（杨杧）自然杂交后代，三者同聚在第Ⅰ类；吕宋杧实选后代粤西1号、田阳香杧、关刀杧、攀西红杧，聚在第Ⅰ类第1组，与罗聪[23]利用SCot分子标记研究结果一致；三年杧实选后代云霞杧、大三年、勐底1号，三者与三年杧GSC值也均大于0.7；印度901杧（秋杧）的后代有桂热杧82号、桂热杧60号、桂热杧80-17号、桂热杧23号等，其与秋杧的GSC值也较大；紫花杧与金穗杧的GSC值达到了0.789 7， 此结果验证了金穗杧是紫花杧的实生后代。对于亲本和子代并未聚集在一类，如桂热杧82号的亲本是秋杧，桂热杧3号的亲本是黄象牙，桂热杧71号亲本是白象牙，却分别聚为不同的2类，可能是由于长期开放授粉和自然选择，培育的新品种在很好的适应各个育种地自然条件的同时，也拥有了相似的遗传基础，形成了因地而异的品种群[24]。

本研究结果说明，AFLP更好地反应了不同来源地的种质。来自广东的大甜香杧、东镇红杧、粤西1号、湛江吕宋杧归为第Ⅰ类第1组，来自海南的兴热2号、枋红杧、文昌白玉、大白玉也归为其中，第1组中包含了来粤、桂、琼3个省的材料，这也一定程度上表明了省间种质交流密切；桂热杧78-1号、桂热杧80-17号、桂热杧23号、紫花杧、金穗杧、红苹杧、桂香杧来自广西的都归为第Ⅰ类的第7组；来自云南的球杧、云霞杧、元江象牙杧、红光6号、三年杧、三蜜杧、勐底1号都归为第Ⅰ类第9组。马切苏是从缅甸引入的实生苗中选出，为印度品种群品种的后代，与印度901（秋杧）聚在一起，亲缘关系表现较近，这与王家保等[7]的研究结果一致，金煌杧、台芽等台湾品种与其聚为一类，由于台湾品种是从美国佛罗里达州的杧果品种后代选育，这也印证了美国佛罗里达州的杧果品种也多是从印度品种后代中选育而出的说法。

根据种子特征可以把杧果品种（系）划分为单胚和多胚两大类群。谢江辉等[25]根据RAPD结果认为分子水平上拟可将单胚类型和多胚类型分开。莫饶等[26]研究发现单胚类材料椰香杧出现多胚现象，频率为5.88%，说明同种种质材料中的胚型会表现出差异。紫花杧是小青皮的后代，然而小青皮种子为多胚，而紫花杧种子却为单胚。本研究也将紫花杧与多个多胚品种（系）聚在第Ⅷ大类，同样椰香杧是原产印度北部的单胚型品种，但却与多个多胚品种（系）聚在一起。上述表明杧果种质在分子水平上不能按种子胚性来明确分类，此结果与王家保等[7]利用ISSR分子标记、雷新涛[14]利用AFLP标记和罗聪[23]利用SCoT分子标记研究结果一致。杧果品种的胚胎发育受环境因素影响，使用一种分子标记来区分胚胎型不够准确。

本研究通过对中国不同省份热区杧果种质进行收集采样，并将其统一引种到农业部儋州杧果种质圃进行保存，为芒果种质资源的创新利用提供了基础。

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