橡胶树1981’IRRDB野生种质及栽培品系ITS序列多态性及其进化分析

龙翔宇　何斌　王闯　胡彦师　秦云霞　方永军　唐朝荣

摘 要 本研究采用核糖体基因转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）标记分析37份橡胶树1981IRRDB野生种质以及7份栽培品系的遗传多样性及其进化关系，拟在DNA序列水平上了解野生种质及栽培品系的遗传背景，为保护、发掘和利用现有橡胶树种质资源提供遗传理论依据。在44份材料中，9份资源种质及1份栽培品系出现ITS基因杂合子现象，ITS序列长度在583～588 bp之间，G+C含量65.52%～67.17%，共有87个变异位点。ITS核苷酸多样性Pi值为0.011 6，其中ITS2的Pi值（0.014 33）明显高于ITS1（0.010 10）及5.8S（0.010 31），表明ITS2序列具有更快的进化速率，更合适于橡胶树遗传多样性及系统学研究。在34个单倍型中，单倍型H8位于网络图的中心，为最古老的高频单倍型，其遗传背景主要来自朗多尼亚州。NJ分子系统树显示大部分栽培品系（热研7-20-59，RRIM600，热研7-33-97，热垦628，热研88-13）与朗多尼亚州（Rodo^nia）部分种质具有相似的遗传背景。此外，中性检测及单倍型网络图结果暗示本研究材料曾经经历一个扩张的历史事件。

关键词 橡胶树；野生种质；栽培品系；ITS序列；遗传多样性

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Genetic Diversity and Phylogenetic Evolution Among 1981IRRDB

Wild Germplasm and Cultivars Using ITS

Markers in Rubber Tree

LONG Xiangyu1， HE Bin2， WANG Chuang2， HU Yanshi1，

QIN Yunxia1， FANG Yongjun1， TANG Chaorong1 *

1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Using internal transcribed spacer（ITS）mark technology， 44 rubber trees including 37 wild germplasm of 1981IRRDB and 7 cultivars were used to investigate the genetic diversity and phylogenetic evolution. Nine wild germplasms and one cultivar presented heterozygosis of ITS sequence. The sequence length was 583-588 bp， and the G+C content was 65.52%-67.17%. There were 87 variable sites in the ITS sequence， and the nucleotide diversity of ITS2（0.014 33）was higher than that of ITS1（0.010 10）and 5.8 S（0.010 31）， showing that ITS2 was a more suitable choice for genetic diversity and phylogenetic evolution. Haplotype analysis showed that H8 was an older and more frequent haplotype， and located in the center of the network graph. Five cultivars and parts of the wild germplasms from Rodo^nia had similar genetic background， and cultivars included Reyan7-20-59， RRIM600， Reyan 7-33-97， Reken 628 and Reyan 88-13. In addition， neutral test and network of haplotype implied that the trees had gone through an event of population expansion.

Key words Rubber tree； Wild germplasm； Cultivar； ITS sequence； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.001

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis），属大戟科，橡胶树属高大乔木，是一种在世界经济和军事发展中均扮演重要角色的热带树种，其生产的天然橡胶是一种重要的工业原料和战略物资。目前，中国天然橡胶的消费量逐年增加，而中国天然橡胶的产量不及消费量的1/5，需求缺口逐年加大[1]。中国适宜种植橡胶的面积有限，实际种植面积已达极限，已经没有扩大种植面积来增加产量的空间，大幅度提高橡胶树单位面积产量是一条适合中国橡胶事业发展和缓解天然橡胶供需矛盾压力的可行性途径。杂交育种一直是橡胶树产量育种的常规方法，然而种质资源的匮乏，特别是狭窄的遗传基础势必制约橡胶树良种培育和产业发展，因此，世界各植胶国均认识到橡胶树种质资源材料的收集及评价的重要意义[2-3]。

评价种质资源材料遗传多样性有助于种质资源的保存及利用。随着现代分子生物技术的发展，分子标记已经广泛的应用于橡胶树遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究[4]，如RAPD[5]，EST-SSR[6-7]，RFLP[8]，AFLP[9]，SNP等[10]。在众多分子标记中，核糖体基因转录间隔区（internal transcribed spacer， ITS）是位于核糖体DNA（rDNA）上18 S和28 S之间的区域片段，主要包括内转录间隔区1（ITS1）、5.8S rDNA、内转录间隔区2（ITS2）。ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，相对变化较大，可以提供丰富的信息位点，目前被广泛应用于植物进化与系统分析[11-15]，而ITS标记在橡胶树中的应用未见报道。

本研究利用ITS序列分子标记技术，对37份1981IRRDB种质，以及7份栽培品系，共44份橡胶树材料的遗传多样性及遗传结构进行分析，拟在DNA序列水平上探讨种质资源以及栽培材料之间的进化关系和遗传背景，为橡胶树种质资源的保护与利用及橡胶树遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

44份供试橡胶树材料收集于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃，其中包括37份1981IRRDB种质，种质主要来源于巴西亚马逊河流区域阿克里州（Acre），马托格罗索州（Mato Grosso）和朗多尼亚州（Rodo^nia）3个州，以及7份栽培品种（RRIM600，PR107，热垦628，热研7-33-97，热研88-13，热研7-20-59，93-114）（表1）。2014年6月，采集幼嫩叶片液氮冻存带回实验室备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及质量检测 取冷冻保存的植物叶片，采用新型植物基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，DP320）提取叶片DNA，并利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳及微量紫外分光光度计（Thermo Scientific，Nanodrop 2000）检测DNA浓度与纯度，-20 ℃保存备用。

1.2.2 ITS区PCR扩增 根据EBI（European Bioinformatics Institute）橡胶树基因组数据库提供的ITS序列设计2对扩增引物，分别为ITSa（ITSaF： 5′-ACG TCG CGA GAA GTC CAT TGA ACC TT-3′，ITSaR： 5′-CCG ATT CTC AAG CTG GGC TCT TCC C-3′）和ITSb（ITSbF： 5′-GAG GAA GGA GAA GTC GTA ACA AAG TTT CCG T-3′，ITSbR 5′-GCT GAG GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT-3′），2对引物扩增相同ITS序列，引物由上海英俊生物工程技术有限公司合成。以44份材料DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25，2.5 μL 10×HiFi Buffer I（含Mg2+），2.5 mmol dNTPs 2 μL，1 U HiFi DNA polymerase（北京全式金生物技术有限公司，Trans Tap TM DNA Polymerase High Fidelity），0.5 μmol引物和50 ng模板DNA。反应程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，68 ℃退火延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用ChemiDocXRS+（Bio-Rad）成像系统观察和拍照记录。

1.2.3 PCR产物的纯化、克隆与测序 PCR产物经凝胶回收试剂盒（美国OMEGA）纯化回收后，连接pMD18-T载体（TaKaRa公司）并转化至感受态JM109（本实验室保存），LB培养基37 ℃培养过夜，经菌斑检测后，每份材料选取5个阳性克隆送至上海英俊生物技术有限公司进行测序。

1.3 数据分析

采用DNAMAN 6.0.3.99软件分析测序结果，确定ITS序列范围，除去两端非ITS序列部分。利用DnaSP 5.10.00软件分析个体G+C含量，变异位点数（Variable，Vs），单倍型数目（Number of haplotypes，h），单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd），核苷酸多样性（Nucleotide diversity，Pi），单倍型多样性方差（Variance of haplotype divversity，Vh），单倍型多样性标准差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh）以及中性检测（Tajima's D和Fu's Fs）等遗传多样性指标进行计算。采用Mega 5.05软件分析个体间的遗传距离，并通过自展分析（bootstrap）做置信度检测，自展数据集为1 000次，邻接法（Neighbor-joining）获得系统发育树。运用NetWork ver 4.6.1.2软件中介邻接网络（Median-Joinging network， MJ）算法构建ITS单倍型间关联图。

2 结果与分析

2.1 供试橡胶树材料的ITS序列特征

本研究利用ITS引物对37份橡胶树种质资源材料及7份栽培材料rDNA-ITS区（包括部分18 S rDNA、ITS1、5.8 S rDNA、ITS2和部分26 S rDNA）进行PCR扩增测序，去除18 S rDNA及26 S rDNA序列，最终得到54条ITS序列。在44份材料中，9份种质资源材料（80、84、92、93、94、101、104、109和122）以及1份栽培材料（热研7-33-97）出现了ITS基因杂合子现象（a，b代表2个杂合子）。DnaSP软件分析表明，ITS序列长度在583～588 bp之间，G+C含量65.52%～67.17%（ITS1：长度223～228 bp，G+C含量65.18%～69.64%；5.8 S：长度162～165 bp，G+C含量54.27%～57.93%；ITS2：长度194～198 bp，G+C含量71.28%～74.87%）（表2）。其中材料94的ITS序列最长（588 bp），其次为热研7-33-97（586 bp），G+C含量最高的材料为88（67.18%），G+C含量最低的材料为122（65.52%）。

2.2 供试橡胶树材料的ITS核苷酸多样性和单倍型信息

进一步分析供试材料ITS序列，该序列存在87个变异位点（单变异位点57个），其中ITS1存在30个变异位点（单变异位点23个），ITS2存在34个变异位点（单变异位点19个），5.8 S存在23个变异位点（单变异位点15个）。除此之外，在ITS区检测到插入缺失位点共9个，其中ITS1存在6个插入缺失位点，ITS2区存在3个插入缺失位点，5.8 S区没有检测到插入缺失位点（表3）。ITS核苷酸多样性Pi值为0.011 60，Theta值为0.034 30，其中ITS1的Pi值为0.010 10，Theta值为0.030 20，ITS2的Pi值为0.014 33，Theta值为0.040 93，5.8 S的Pi值为0.010 31，Theta值为0.032 11。Pi值结果显示，变异位点分布相对均匀，ITS2发生变异略高于ITS1和5.8S（表2）。

根据ITS核苷酸变异位点，最终确定34个单倍型，其中单倍型H8在供试材料中分布最广，共8个材料（82、87、109、121、热垦628、热研88-13、热研7-33-97），其次为单倍型14，共6个材料（89、92、95、96、106、123），其余单倍型只分布在少数个体中，单倍型多样性Hd为0.964，多样性方差Vh为0.000 20，多样性标准差Sh为0.014（表1和表3）。ITS1存在17个单倍型，其单倍型多样性Hd为0.744（Vh=0.002 50，Sh=0.050）；ITS2存在18个单倍型，其单倍型多样性Hd为0.752（Vh=0.002 55，Sh=0.051）；5.8 S存在10个单倍型，其单倍型多样性Hd为0.581（Vh=0.005 21，Sh=0.072）。ITS1与ITS2单倍型多样性Hd相近，略高于5.8 S单倍型多样性Hd（表3）。

ITS中性检验分析结果Tajima's D和Fu's Fs均为负值，且达到显著水平，分别为-2.327（p<0.01）和-4.065（p<0.02）（表3）。此外，ITS1和5.8 S的中性检验结果Tajima's D和Fu's Fs同样呈现负值，且达到极显著水平，ITS2达到显著水平。中性检验结果说明ITS遗传结构偏离中性假说，内部存在自然选择作用，也预示本研究群体曾经经历了一个扩张的历史事件。

2.3 供试橡胶树材料间的遗传距离及系统进化分析

采用Mega软件计算供试材料IST遗传距离，其遗传距离在0～0.076 cM之间，存在高度的相似性。部分材料之间ITS序列完全相同，遗传距离为0 cM，此外，材料83与84 b（遗传距离为0.076 cM），84与109 b（遗传距离为0.074 cM）之间遗传距离相对较大。基于ITS之间的同源性，采用邻接法（Neighbor Joining）构建系统进化树，结果显示将44份材料（54条ITS序列）分为5大分支（图1）：分支Ⅰ包含9个材料，主要来自阿克里州；分支Ⅲ包含材料最多24个，主要来自于朗多尼亚州，此外，还包含了5个栽培品系热研7-20-59，RRIM600，热研7-33-97a，热垦628，热研88-13；分支Ⅳ包含了6个材料，主要来自马托格罗索州，其中包含栽培品系热研7-33-97b；另外2支Ⅱ和Ⅴ的材料相对复杂，包含了阿克里州，马托格罗索州和朗多尼亚州3个地区的部分材料，以及栽培品系PR107，93-114。

2.4 橡胶树ITS单倍型中介网络图

采用NetWork软件中介邻接网络算法对橡胶树44个个体34种单倍型绘制网络图，图中明显识别4个主体单倍型（图2），其余单倍型围绕主体单倍型呈星状排列，说明主体单倍型H8，H18，H14，H22相对原始。其中单倍型H8由3份栽培材料（热垦628，热研88-13，热研7-33-97）和5份朗多尼亚州材料共享，单倍型14由3份朗多尼亚州，2份马托格罗索州和1份阿克里州材料共享，单倍型18由2份马托格罗索州材料共享，单倍型22仅有1份阿克里州材料。主体单倍型之间仅保留2～3步变异，主体单倍型与其他单倍型之间大部分只保留1～2步变异，仅少数单倍型之间保留（H8→H9，H8→H25，H14→H12，H14→H7）3～4步变异。此外，单倍型中介网络图进一步支持了供试橡胶树材料邻接聚类分析结果，个体之间并没有完全的依据采样地形成分支。

3 讨论与结论

种质资源是橡胶树选育种的基础，直接影响橡胶树优良品种的选育。目前，中国橡胶树种质资源比较丰富，已保存包括魏克汉种质、非魏克汉种质、1981IRRDB种质和橡胶树属的其他种和变种共6 041份[16]。为拓展橡胶树遗传基础，以1981IRRDB种质资源为主体，从产量、生长、抗病等主要性状方面，积极开展种质资源的鉴定评价与创新利用研究，并取得一定进展[3，17]。

本研究基于ITS序列标记法，分析44份橡胶树材料遗传多样性，其有9份种质材料以及1份栽培材料存在ITS基因杂合子现象，由于橡胶树是典型的异花授粉树种，从而形成遗传上的高度杂合性现象。在被子植物中，ITS区域的总长度在500～750 bp之间，ITS1和ITS2序列G+C含量基本一致，反映出协同进化的现象[18]。本研究44份材料的ITS序列长度相对恒定，ITS1、5.8 S和ITS2序列G+C含量存在差异，且ITS2序列G+C含量最高，ITS1序列次之，5.8 S序列G+C含量最低（表2），G+C含量是基因组结构进化中的一个重要因素[19]。

核苷酸多样性（Pi）和单倍型多样性（Hd）可以反映ITS序列遗传多样性，核酸多样性分析结果显示ITS2的Pi值明显高于ITS1及5.8 S，其中具有明显特征的变异位点可作为特异DNA指纹鉴别位点（表2）。而在单倍型多样性分析中，ITS1与ITS2单倍型多样性Hd基本相近，且远高于5.8 S（表3）。整体而言，ITS2核酸变异水平明显高于ITS1及5.8 S，表明ITS2具有更快的进化速率，因此ITS2更适合于橡胶树遗传多样性及系统学研究，类似结果在其他一些植物的研究中也有报道[20-23]。此外，中性检验结果表明ITS遗传结构偏离中性假说，内部存在自然选择作用，也同时预示本研究群体曾经经历了一个扩张的历史事件。单倍型网络图显示单倍型H8位于网络图中心，为最古老的高频单倍型，各单倍型之间关系较近，进步一证明ITS序列相对保守。

另外，本研究以54条橡胶树ITS序列构建NJ分子系统树（图1），在5大分支中，分支Ⅲ包含材料最多，主体单倍型H8和H14均在此分支，主要包含了朗多尼亚州的部分材料，以及5份栽培品系。热研7-20-59，热研7-33-97及热研88-13拥有共同的亲本RRIM600，因此共同属于分支Ⅲ，进一步说明它们的遗传背景主要来自朗多尼亚州[16]。1994年，RFLP标记结果显示橡胶树野生种多态性高于栽培种，朗多尼亚州和马托格罗索州种质多态性高于阿克里州[24]。另外2个栽培品系PR107和93-114与马托格罗索州的103材料遗传距离最近，推测其遗传背景主要来自马托格罗索州。

致 谢 本研究所用橡胶树种质及栽培材料均由国家农作物种质资源平台-国家橡胶树种质资源子平台提供。

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