病毒灭活冷沉淀的外用研究进展

冯秋斌 王艳红 赵苏丹 刘占彦 李会来 赵琦 张娜

冷沉淀(Cryo)每袋由200 ml 血浆制成。在100 ml新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀中，FⅧ因子的含量应≥40 U，Fg 的含量应≥75 mg［7］。为了保障冷沉淀的质量，血站通常对血浆不做病毒灭活处理直接制作出冷沉淀或仅滤除白细胞制作成去白细胞冷沉淀凝血因子。由于输血可以引起血源性疾病的传播和同种免疫反应［8，9］，对于所有的血液制剂来说风险较高的是输注冷沉淀，更容易使病毒传染［10］。在1 ～5℃温度下新鲜的冰冻血浆产生的白色沉淀物就是冷沉淀，具有不溶解的特性，直到37℃的时候才会溶化，其主要成分是Ⅶ因子、Ⅻ因子、纤维蛋白原以及纤维结合蛋白等。冷沉淀最早是用来治疗血友病的，因为其中有大量的Ⅷ因子，这也正是对治疗效果带来影响的主要因素。当前新鲜的冰冻血浆和普通的冷冻血浆以及冷沉淀凝血因子是临床中应用最为广泛的血浆制品。其中新鲜的冰冻血浆中除了含有正常人的血浆蛋白之外还具有全部凝血因子，非常适合出血性疾病患者以及输血期间出现凝血障碍的患者。但是如果血液供应者当前正处于病毒感染的窗口期，没能够及时检测病毒的存在，则可能导致受血者感染病毒。当前国内常用的病毒灭活技术能够有效的预防由于输血或者是血液制品造成的传染性疾病，降低输血带来的风险，在各类疾病的治疗中发挥出巨大的作用。但是作为一种新型的血液制品，冷沉淀凝血因子的治疗标准仍处于讨论当中，进行进一步的研究探讨对于提高冷沉淀的临床应用质量非常关键。

1 冷沉淀的作用机制

冷沉淀是由五种主要成分组成的，分别是FⅧ、Fg、纤维结合蛋白以及vWF，其中FⅧ是一种大分子复合物，又叫做抗血友病球蛋白，通过加快FX 活化速度来帮助血小板尽快聚集，这样一来内源性凝血活酶的形成速度就会加快，对于内源凝血系统的激活有促进作用。粘性糖蛋白Fn 不仅可以有效的抑菌、抗感染并且调控免疫力，同时还可以对纤维蛋白的交联、细胞粘着，可以有效的修复和分化。Fg 含量的增加增强了血小板的聚集功能以及凝血途径的速度。相比起FFP来说冷沉淀中Fg、FⅫ以及FⅧ的活性都有大量的增加。冷沉淀含有多种成分，其主要成分的作用机制见表1。

2 冷沉淀的制备

手工制作冷沉淀的传统方法如下:将血液采集后在6小时以内将其制备为新鲜的冰冻血浆也就是FFP，然后用4℃的水轻轻摇动血浆将FFP 溶化，在还有60 ml冰渣的时候将其取出并进行15 min 的离心，并且将血浆在无菌条件下进行移除，余下的未能溶解的白色胶状物约有20 ml 左右，将其冻存在冰箱内并保持零下30℃的温度就可以形成冷沉淀。通过研究可以看出冷沉淀中的含有的凝血因子会受到血型、储藏时间这两个因素的影响，冷沉淀在融化以后FⅧ的活性就随之储藏时间而不断降低［11］。

表1 冷沉淀成份及作用机制

3 冷沉淀的病毒灭活

使用病毒灭活有机溶剂法(SD)来进行冷沉淀的病毒灭活，可以将病毒灭活的性能有效的提高，同时Fg、FⅧ以及vWF 的活性都可以得到提高。具体的方法是加入2%的磷酸三丁酯(TnBP)在冷沉淀中，置于37℃下4 h，或者加入1%的TnBP 和1%的Triton X-45也可以达到效果。冷沉淀中的FⅧ、vWF 以及具有凝血活性的Fg 在经过这个办法的灭活之后平均回收率可以达到93%以上。

4 治疗方法

4.1 用于HA 的治疗 HA 又名抗血友病球蛋白缺乏症，轻型的成人以及儿童HA 出血都可以使用冷沉淀来进行预防和治疗。约有一半的冷沉淀在临床上用于胸外科手术以及心血管手术［12］，血友病患者在进行外科手术的时候的出血可以使用冷沉淀来进行预防和治疗并且疗效显著。应用冷沉淀的频率保持在2 ～3 周/次，剂量为2 U/10 kg，但发现有大量的出血迹象或者需要输血的时候可以使用10 ～20 U/次的冷沉淀进行输注，同时进行一定量的血小板以及抗凝血酶制剂的补充。但是冷沉淀长期使用会产生FCⅢ:C 抗体，对治疗效果不利。很多发展中国家目前仍然首选冷沉淀来进行FⅧ缺乏的治疗，但是发达国家中得到最广泛应用的是FⅧ浓缩物，由于其价格昂贵所以无法在发展中国家得到广泛的应用，但这是目前对血友病患者进行治疗的主要发展方向。

4.2 用于vWD 的治疗 vWD 的临床表现是出血以及出血时间长，是由于vWF 的缺乏或者异常而导致的。如果对vWD 出血患者使用其他的浓缩剂治疗无效的时候就适用冷沉淀。原始的血浆中约有一半的vWF 会在制备过程中被保留在冷沉淀中，使用的剂量为1 U/10 kg 体重，所以使用冷沉淀治疗一些比较特殊的vWD 患者是可行的，FⅧ浓缩物在经过了病毒灭活之后也可以用来对vWD 进行治疗，因为其中的vWF含量丰富。

4.3 用于Fg 症的治疗 Fg 缺乏有两种，分别是遗传性Fg 缺乏症和获得性Fg 缺乏症，对于后者来说标准的治疗方法就是使用冷沉淀来进行治疗。冷沉淀主要是用于对预防具有出血倾向的患者以及治疗低Fg 血症性出血，是替代Fg 浓缩制剂而存在的，使用的剂量由众多因素共同决定，例如患者的Fg 水平、血容量、出血是否严重以及所使用的冷沉淀的质量等，Fg 在输注了冷沉淀之后可以提高至1.0 g/L。以下三种情况的患者适用冷沉淀进行治疗，一是患者的Fg 水平低于1.0 g/L 并且微血管出血情况严重，具有外伤和拟进行侵入性操作;二是患者由于微血管内出血严重需要大量输血，但是其Fg 水平无法及时进行测量的情况;三是患者先天缺乏Fg(1.0 g/L ＜Fg ＜1.5 g/L)并且有潜在的出血危险，或者患者存在进行性出血的情况。单独缺乏Fg 的情况很少，尤其是成人因此出血的情况就更少了，最常见的Fg 缺乏就是DIC，如果患者低Fg血症严重并且并发DIC，那么FFP 的单独应用量对于Fg 的提升无法超过1.0 g/L，但是进行冷沉淀输入则可以将Fg 水平至少提高到0.75 g/L。输入冷沉淀适应证会在DIC 得到缓解之后消失。

4.4 对Fn 进行补充 如果创伤或者感染情况严重会大量的消耗Fn，在输入冷沉淀之后30 min 可以明显的提升Fn 含量，这种高水平一直可以持续2 h。冷沉淀应用最有效的情况是粘膜病变的时候，吞噬细胞会在高浓度Fn 的促进下不断提高其吞噬作用，起到伤口净化的作用［13，14］，并且通过间质作用将细胞间的结合进行了加固。当人体患上了白血病以及一些恶性肿瘤之后，体内的Fg 和Fn 降低情况明显，在肿瘤切除过程中输入冷沉淀不仅可以止血和预防感染，同时可以抑制癌细胞的扩散。

4.5 对凝血功能障碍进行纠正 换上了凝血功能障碍的患者在进行大手术的时候需要大量的数学，但是如果只选用库存血输入的话不仅没有止血效果，而且会消耗或者稀释凝血因子，扰乱凝血功能。应该将FFP、冷沉淀和血小板进行配比混合然后输入［15］，对于凝血功能异常有良好的纠正作用。

4.6 冷沉淀治疗感染的作用机制 补充内源性凝血因子，纠正凝血功能紊乱［16］;稳定红细胞膜，加强其在体内的免疫功能;促进单核巨噬细胞的吞噬功能;补充和调节Slit2 蛋白分泌，稳定溶酶体膜;稳定内环境。

4.7 恶性肿瘤与冷沉淀 恶性肿瘤患者凝血功能紊乱，常处于高凝状态，易形成静脉血栓、动脉血栓和血栓性静脉炎;高凝状态促进肿瘤的生长和转移，与患者的预后有着密切关系:大量组织因子活化了凝血途径;纤维蛋白原的分解及纤溶系统受到抑制;抑制凝血途径激活、降低纤维蛋白原浓度是治疗肿瘤患者的重要措施;预防性使用抗凝药物可以明显改善预后;冷沉淀含有大量的纤维蛋白原及其他凝血因子，激活凝血功能，处于高凝状态的恶性肿瘤患者应慎用;当肿瘤患者发生大出血时，应根据凝血功能检测结果补充凝血因子，用量宜偏小，止血即停用。

4.8 冷沉淀中的Slit 蛋白 冷沉淀是人体血浆中的精华，含有Ⅰ、Ⅷ、す、vWF 以及Slit 蛋白、纤维结合蛋白等;是浓缩的凝血因子，主要用于大出血、DIC 出血期及低凝期，还用于抗感染治疗，治疗剂量8 ～12 U/次，必要时连续应用。冷沉淀中的Slit 蛋白是一种分泌型糖蛋白，由1 个N-端信号肽、4 个富含亮氨酸的重复序列(LRRs)、9 个EGF 样重复序列和1 个C-端的半胱氨酸结合而成。受体Robo 胞外区是由5 个Ig 样功能区和3 个FN 样结构域组成，胞内区由4 个CC 基序组成。

5 在临床外用方面冷沉淀的新进展

5.1 深度烧伤 基底细胞会由于二度烧伤而受到损伤，例如汗腺等恢复过程十分缓慢。使用冷沉淀喷洒在创面可以将修复时间大幅缩短，因为冷沉淀中富含的纤维结合蛋白可以有效的促进创伤愈合，同时还有防止感染以及帮助创伤组织尽快修复的作用［17］。

5.2 皮肤和黏膜疾病 在黏膜发生病变的时候，病区周围的上皮细胞的Fn 分泌会停止或者受到破坏，而冷沉淀中富含Fn，可以形成一个坚固的网状结构来对细胞表面进行保护，同时控制炎症、维持渗透压并且修复创口［18］。同时使用冷沉淀治疗外阴白斑这种常见的妇科疾病疗效显著，并且治疗方法非常简单，局部封闭配合外敷即可［19］。

5.3 角膜疾病 病毒性角膜炎、泪液减少症、眼外伤、角膜烧伤、单独性角膜上皮糜烂以及单纯疱疹病毒性角膜炎都可以使用冷沉淀制备的眼药水进行治疗，可以消除充血情况、对损伤进行修复，并且可以起到修复视力的作用［14］。

6 最新动态

冷沉淀在临床外用方面有着其他药剂不可比拟的独到之处，无论局部注入、局部喷洒或点滴、口服、促进创面愈合及治疗皮肤、黏膜疾病、角膜疾病等疗效都非常显著，况且来源容易、使用简单［20］，但是冷沉淀作为一种特殊的血液制剂也可能引起血源性疾病的传播，而一旦传播极有可能造成多人次爆发感染。国内文献关于冷沉淀的应用研究报道较多，但鲜有研究指明用的冷沉淀经过病毒灭活。故此在制作外用冷沉淀时除了严把血源检测外更应该进行血浆病毒灭活，病毒灭活后的冷沉淀对其外用有更加实际的临床意义。

总而言之，基于输血安全性以及降低传播病毒风险的角度来看，病毒灭活冷沉淀非常必要。尽管我国当前输血安全性得到显著提高，但是受技术条件的制约，病毒的窗口期等因素难以完全排除，同时可能出现过敏性休克等难以预测的输血不良反应，对输血质量造成较大的影响。临床研究中有部分患者输注冷沉淀的过程中可能出现变态反应，尽管患者的症状较轻，也应当及时停止应用，改用凝血酶或者是其他血液制品。且有大量的研究资料显示，对危重患者应用冷沉淀凝血因子，其心脏、肺部和肝肾等器官功能均得到一定的改善，对于临床患者的救治具有重要意义。在今后的工作中还应当进一步探讨病毒灭活冷沉淀在临床中的应用情况，拓宽其应用渠道、减少不良事件的发生，产生更大的效益。

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