红细胞免疫粘附功能及CR1 基因多态性对危重型手足口病的预警作用

赵瑞芹 付海燕 张丽霞 徐梅先 王凤英 殷春兰 安会波

自1969 年美国首次报道EV71 感染性疾病后［1］，世界多数国家发生了暴发流行，在大流行时期，EV71感染患者出现了严重的并发症及死亡病例。我国台湾地区在1998 至2008 年发生3 次暴发流行，因EV71 感染致死病例约为250 例［2］。大陆地区安徽阜阳2008年出现暴发流行，20 余例患儿死亡，随后全国各地报道了该病的流行。近年每年均有手足口病暴发流行，并出现不少重症病例及死亡病例。手足口病成为我国儿童期死亡的重要原因之一。多数手足口病临床表现轻，预后较好。而重症手足口病病情进展极为迅速，部分患儿就诊时即有严重的脑损伤，并迅速进展为肺出血、肺水肿导致死亡。挽救重症患儿、降低死亡率的关键在于早期识别重症患儿。随着对手足口病的关注增加以及研究的进一步深入，国内外学者分析总结了重症手足口病患儿的高危因素，如年龄小于3 岁，持续发热＞39℃，持续3 d 以上，血糖升高＞8.3 mmol/L，血常规白细胞＞17.5 ×109/L，肢体无力、心率增快等等［3－5］。文献报道红细胞免疫黏附功能、红细胞CRl密度相关基因组多态性对肿瘤、糖尿病、肾病综合征、严重脓毒症，以及传染性疾病如病毒性肝炎、严重急性呼吸综合征等疾病具有临床评估病情变化、疗效观察、判断预后的重要指示意义［6，7］，其对手足口病的预警作用至今笔者尚未发现文献报道。本研究通过探讨红细胞免疫黏附功能、CR1 基因多态性与手足口病的病情变化相联系，通过对临床病例的研究，建立有效的判断预后指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2011 年4 月至2012 年2月期间我院住院手足口病患儿111 例。患儿咽拭子采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测EV71，结果均为阳性。患有先天性心脏病、免疫缺陷、脑瘫等基础疾病者，近期有麻疹、结核等传染病史者及近期应用免疫球蛋白者不纳入本研究。根据《肠道病毒71 型(EV71)感染重症病例临床救治专家共识》［8］，将患儿分为3 组。

1.1.1 死亡组:患儿入院后迅速进展至心肺衰竭，经积极救治无效死亡，共6 例。

1.1.2 危重组:患儿病程进展至手足口病心肺衰竭前期及心肺衰竭期，有心率、呼吸增快，出冷汗、皮肤花纹、四肢发凉，血压升高，血糖升高，外周血白细胞(WBC)升高，病危患儿出现口唇紫绀、咳粉红色泡沫痰或血性液体等表现，经积极救治，患儿逐渐恢复，共57 例。

观察组34例中，有效23例，部分有效8例，无效2例，复发1例，总有效率为91.18%；对照组34例中，有效12例，部分有效15例，无效5例，复发2例，总有效率为79.41%，观察组明显优于对照组，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

1.3.4 琼脂糖电泳:取12 ～15 μl 酶切反应液用2%琼脂糖凝胶电泳。酶切后分3 种基因型。高表达(HH):只有与扩增物(1.8 kb)相同分子量一条带的标本;中表达(HL):有1.8 kb、1.3 kb 和0.5 kb 三条带;低表达(LL):只有1.3 和0.5 kb 两条带。

1.2 方法 患儿入院次日晨留取静脉血3 ml，枸橼酸钠抗凝，分别进行以下检测。

1.2.1 红细胞天然免疫粘附功能检测

1.2.1.1 血标本处理:将枸橼酸钠抗凝血2 ml 水平离心(2 000 r/min)，使红细胞沉淀。

对照组接受常规护理，嘱咐患者按时按量服药，并基于患者的病情予以饮食指导，对患者日常生活进行精心照顾，预防产生各种意外事件的出现。

1)本自适应调节系统的静态仿真实验表明，系统控制的相对误差均在5%以内，其中当该系统工作在半量程区间时，有着较好的控制精度。

散会后，大家一起到二楼的餐厅聚餐。席间，齐眉给每人分发了一个红包。高潮拿到红包后，心里直痒痒，瞅个机会跑到卫生间，偷偷地打开红包，一看，壹仟圆，心里美滋滋的。高潮不想喝太多的酒，就赖在小隔间，坐在马桶盖上把玩手机耗时间，反正这里也很干净，一丝儿异味都闻不到。不大会儿，就听到外面两个小便的人在交谈。一个说，乖乖，好大方，红包就装了贰仟圆。另一个嚷嚷道，这狗日的梅董也太狗眼瞧人低了吧，只给了老子陆佰块。高潮听第一人说的时候，心中就诅咒了梅宏图几句，待第二个人的话一出口，高潮登时心平气和了。

1.3.2 基因组扩增:取PCR 绿色体系(普洛麦格北京生物技术有限公司)12.5 μl 反应液。取上、下游引物(5’-CCTTCAATGGAATGGTGCAT-3’，5’-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3’)各1 μl 混匀液加入0.5 ml Eppendorf 管，加DNA 提取液3 μl 加双蒸水使总反应体系至25 μl。扩增条件为:94℃预变性5 min;然后94℃，60 s;55℃，50 s;72℃，50 s 扩增30 个循环，最后72℃延伸5 min。

1.3.1 基因组抽提:应用血液基因组DNA 抽提试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)抽提外周血DNA，实验步骤按说明书进行。

1.2.1.4 结果判断:轻轻将反应管中的液体摇匀，取反应液20 μl 置玻璃片中间，加盖玻片，待细胞沉淀5 min 后，用相差显微镜阅片。结合5 个以上红细胞的靶细胞为一个结单位，计数100 个靶细胞，计算粘附率。

1.3 红细胞CR1 分子基因多态性检测

1.2.1.3 加样:取0.5 μl 红细胞和50 μl 血浆加到靶细胞管，摇匀，37℃，水浴30 min。

1.2.1.2 靶细胞的配制:37℃溶解靶细胞，加1 ml PBS(磷酸盐缓冲液)，充分混匀，水平离心4 000 r/min，离心5 min，弃净上清液(勿将细胞吸掉)，加100 μl PBS 充分混匀，备用。

1.3.3 限制性内切酶酶切:基因扩增产物以Hind Ⅲ酶(普洛麦格北京生物技术有限公司)酶切，取6 μl 酶切反应液与14 μl PCR 扩增物混匀，置于37℃恒温水浴箱内放置1 h，终止酶切。

1.1.3 对照组:患儿病程处于出疹期及神经系统受累期，有手掌、足底或臀部皮疹、口腔疱疹溃疡，患儿出现精神差、嗜睡、易惊、头痛、呕吐、烦躁、肢体抖动、急性肢体无力等表现，本组所有患儿均未进展至心肺衰竭前期及心肺衰竭期，共48 例。

以建筑单体为基本评价单元,结合8个关键影响因子,用Excel表进行统计.屋顶绿化资源潜力评估方法见表2．

2.2 3组患儿红细胞免疫粘附功能与CR1 基因多态性的比较 危重组患儿的红细胞免疫粘附功能低于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

2 结果

2.2 仙居县古树分布区类型和变型 全县现有古树中含13个属的科为壳斗科(Fagaceae)，有1 389株，占总数的28.46%；含有6个属的科有蔷薇科(Rosaceae)、榆科(Ulmaceae)和柏科(Cupressaceae)，共有250株，占总数的5.12%；含2～5个属的科有20科，共有3 140株，占总数的64.34%。按照世界种子植物科的分布区类型[9]和中国种子植物属的分布区类型[10] 标准划分，可将仙居县古树科和属的分布区类型分别划分为10、20个类型(表2)。

表1 3 组一般情况比较

1.4 统计学分析 应用stata 10.0 统计软件，采用Wilcoxon 秩和检验及Fisher 确切概率法，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表2 3 组患儿红细胞免疫粘附功能比较 ± s

表2 3 组患儿红细胞免疫粘附功能比较 ± s

注:PS-C:危重组与对照组之间的差异;PS-D:危重组与死亡组之间的差异;PD-C:死亡组与对照组之间的差异

组别 红细胞免疫粘附功能 统计值死亡组(n =6) 18.33 ±7.50 chi-squared with ties = 24.452 with 2 d.f ;P =0.0001危重组(n =57) 22.45 ±8.50 PS-C= 0.0000 (z = －4.307)对照组(n =48) 35.76 ±17.82 PS-D=0.0308 (z = －2.160)PD-C=0.0024 (z = －3.029)

2.3 3组之间CR1 基因多态性分布 危重组与对照组的CR1 基因多态性构成比的差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表3。

2.1 一般情况 危重组男37 例，女20 例;死亡组男4 例，女2 例;对照组男30 例，女18 例;危重组与死亡组患儿月龄之间差异无统计学意义(P ＞0.05)。2 组患儿月龄均小于对照组，2 组差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表3 3 组间CR1 基因多态性分布情况 例(%)

3 讨论

手足口病目前在大陆地区仍有不同范围不同程度的流行和小暴发，尤其是重症、危重症患儿，易造成神经系统后遗症，对儿童的身心健康造成严重影响。我国2011 年发病人数为1 610 706 例次，死亡509 例，2012 年手足口病发病人数为2 168 737 例次，死亡567例，2013 年发病人数约1 467 694 例次，死亡约225例［2，3］。手足口病仍是严重威胁我国儿童生命健康的传染病之一。

高热、惊厥、恶心呕吐、入院时中性粒细胞增高是重症手足口病的危险因素，而年龄＜1 岁或＞5 岁，舒张压偏高是保护性因素。临床工作当中，上述部分因素有可能受到外界环境影响，如合并呼吸道或消化道感染、患儿恐惧、剧烈哭闹等影响［9］。重症手足口病患儿的预后因素目前已进行了多方面研究，但引起重症手足口病的发病机制仍未完全清楚，推测可能与病毒直接侵犯组织细胞(如脑组织)或病毒入侵所致异常免疫反应有关。重症致死病例可表现为迅速进展的交感神经紧张、肺水肿、肺出血、心肺衰竭，研究发现这些患儿心功能正常、肺动脉压力正常、外周血管阻力正常，且尸检并未发现心肌炎表现，因此心肺衰竭、肺水肿不能完全用血液动力学改变来解释。而广泛的系统炎性反应，释放促炎因子参与脑干脑炎、肺水肿的形成，脑干损伤和(或)由于细胞因子释放导致的系统炎性反应综合征是形成肺水肿的重要原因，如白介素(IL-6、IL-10、IL-13)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的升高以及CD4、CD8 和NK 细胞的损耗，与致命的肺水肿关系密切［10，11］。TNF-α 和IL-6 是调节免疫应答的细胞因子，是集体免疫防护的重要介质，但也参与集体的免疫病理损伤。TNF-α 介导炎症反映的许多病理生理过程，促进炎症细胞黏附、游走、浸润级中性粒细胞脱颗粒，同时可以作用于单核巨噬细胞释放炎性介质而加剧炎性反应，引起局部的免疫反映甚至系统损害。HFMD 患儿体内广泛免疫炎性反应，高水平的前炎性因子进而激活其他效应细胞，引起连锁反应及放大效应即瀑布效应引起SIRS 及多脏器功能障碍综合征。

红细胞是血循环中重要的天然免疫细胞之一，是机体对异物和免疫复合物起免疫粘附作用的主要细胞。由于血液循环中红细胞与白细胞之比值为(500 ～1 000)∶1，因此红细胞与外界侵入的异物或免疫复合物相遇的机会较白细胞要高很多，在机体免疫反应及其调控中占有重要的地位。成熟红细胞膜表达CR1、CD44、CD58 等物质，对循环炎性物质具有重要的粘附结合及清除作用;其清除免疫复合物的方式主要有3 种，通过过氧化物酶直接消除粘附的抗原物质;促进吞噬细胞对抗原的吞噬;红细胞本身不仅可以粘附免疫复合物，还可粘附自身T 细胞，将抗原提呈给T细胞，增强T 细胞的免疫功能，更有效地清除免疫复合物。本研究中，死亡组及危重组患儿红细胞免疫粘附功能较对照组均有显著下降，且2 组之间差异也具有统计学意义，提示红细胞免疫粘附功能的不同程度的下降，导致对炎性介质清除能力的下降，分别与疾病的发展及预后密切相关。对入院手足口病患儿进行红细胞免疫粘附功能的监测有助于了解HFMD 患儿预后，以及早进行干预，减少死亡率。

红细胞发挥免疫功能尚需通过其表面的CR1 来进行。CR1 通过与机体内免疫复合物(IC)结合，将其运送至肝脏、脾脏的网状内皮系统清除，以清除病灶。正常人红细胞的CR1 呈高、中、低三种表达状况，以HH 为主，HH 型红细胞CR1 活性明显高于HL 型和LL 型，是影响红细胞免疫粘附功能的一个重要因素。CR1 的表达由CR1 基因HindⅢ酶切位点多态性遗传决定，也与疾病有关。本研究中死亡组患儿CR1 以HL 型为主，占到50%，HH 型为33.33%，而危重组和对照组以HH 型为主，分别为77.19%、77.08%，与正常人相同。3 组之间的差异虽无统计学意义，但对CR1 呈中低表达的患儿尚需密切关注。

某防护结构墙体混凝土配合比优化及温度控制………………………………………… 曾鸣，仲新波，揭英强（6-3）

红细胞免疫是机体免疫的重要组成部分，近年来的研究使红细胞免疫在免疫物质基础、免疫功能等各个方面日趋完善。红细胞免疫粘附功能对肿瘤、糖尿病、肾病综合征、严重脓毒症等疾病具有观察疗效、判断预后的功能，本研究提示其对于重症手足口病预后同样具有预警作用。

手足口病病情进展快，病死率较高，对手足口病重症患儿的早期识别仍是挽救患儿、降低死亡率的重要预防治疗方法之一，发展更多的重症手足口病预警指标具有重要意义。

1 Schmidt NJ，Lennette EH，Ho HH.An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system.J Infect Dis，1974，129:304-309.

2 Wang SM，Ho TS，Shen CF，et al.Enterovirus 71，one virus and many stories.Pediatr Neonatol，2008，49:113-115.

3 高媛媛，杨思达，陶建平，等.累及神经系统手足口病患儿临床特征及危重症危险因素分析.中国循证儿科杂志，2010，5:135-140.

4 Chen SC，Chang HL，Yan TR，et al.An eight-year study of epidemiologic features of enterovirus 71 infection in Taiwan.Am J Trop Med Hyg，2007，77:188-191.

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9 杨朝晖，秦承志，季金萍，等.儿童手足口病1570 例危险因素的病例对照研究.中华传染病杂志，2014，32:154-157.

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11 Wang SM，Lei HY，Huang KJ，et al.Pathogenesis of enterovirus 71 brainstem encephalitis in pediatric patients:roles of cytokines and cellular immune activation in patients with pulmonary edema.J Infect Dis，2003，188:564-570.