混凝好氧颗粒污泥絮凝剂微生物毒理实验研究

易 诚，龙九妹，刘 最，彭 钢

（1.衡阳师范学院生命科学系，湖南 衡阳 421008；2.衡阳师范学院化学与材料科学系，湖南 衡阳 421008）

0 引 言

自1991年Mishima等［1］第一次报道了利用连续流AUSB反应器培养出好氧颗粒污泥以来，好氧颗粒污泥技术作为一项新型废水生物处理技术成为研究的热点。快速培养好氧颗粒污泥成为好氧颗粒污泥工业化需要解决的问题，宋雪松等［2－4］通过添加聚合氯化铝（PAC）、易诚等［5，6］通过利用聚丙烯酰胺（PAM）进行混凝强化促进好氧颗粒污泥形成的研究。使絮凝剂毒性成为被关注的问题，发光细菌毒性试验具有快速、直观、全面的特点，其具有试验费用低、毒性效应明显、试验周期短等优点，从而被广泛应用于水质综合毒性检测中［7－8］。为选择混凝效果良好絮凝剂，本团队进行了混凝好氧颗粒污泥絮凝剂的选择研究［9］，选择常用的PAM、PAC（聚合氯化铝）及壳聚糖为絮凝剂，为保证絮凝剂对微生物安全有效，本研究利用发光菌检测法（GB／T15441－1995）进行絮凝剂微生物毒理实验研究。

1 实验材料与方法

1.1 试剂与材料

（1）实验菌种：湖南省环境监测站提供的明亮发光杆菌T3小种冻干菌粉（800万Cell／g）。

（2）聚炳烯酰胺（分析纯，分子量在400－500万）浓度为弱阴离子型聚丙烯酰胺（PAM）。

（3）聚合氯化铝，Al2O3含量33.32%，盐基度83.66%。

壳聚糖（食品级，脱乙酰度为85%，黏度为800，分子量在100万左右）。

（4）培养基：胰蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，NaCl 30.0g，KH2PO41.0g，Na2HPO45.0g，甘油3.0g，加蒸馏水定容至1000ml，调节pH7.0±0.5，制成液体培养基。在液体培养基中加入琼脂169g，制成固体培养基。

（5）稀释液 根据要求使用3%NaCl溶液和2%NaCl溶液。

（6）仪器与器材

生物发光光度计、比色管、恒温振荡器、培养箱、手提式高压消毒锅、移液器、容量瓶、三角瓶等。

1.2 实验方法

1.2.1 发光菌复活

冷藏的发光菌冻干粉，加入冷的2%NaCl溶液0.5ml，置冰浴中，充分摇匀，复苏2min，使其初始发光量在600－1900mv之间［10］。

取不同浓度待测液2mL入磨口比色管，每浓度设3管重复，以2mL NaCl（3%）溶液作对照（CK）。取培养好的菌液2mL用NaCl（3%）溶液适当稀释，充O2振荡均匀后取2mL入各比色管中，加塞摇匀后去塞，15min后检测发光强度，每浓度取平均值［11］。

1.2.2 样品液制备

样品制备条件的确定 样品的毒性，与其含量、固有毒性及在溶液中分散程度等有关，还与悬浮液的制备条件有关［12］。以浓度为10000mg／L 的PAM溶液对明亮发光杆菌T3进行2组悬浮液制备条件的平行实验。结果表明：实验液制备条件的主要因素包括搅拌时间、搅拌速度及静置时间，经毒性实验确定样品液制备的条件为：搅拌速度300 r／min、搅拌时间为10min、静置时间为10min。

样品制备 将待测样与3%NaCl溶液以1∶9（体积比）混合，在300r／min条件下搅拌10min，后再静置10min后，取混悬液中层部分并稀释成浓度不同的悬浮液样品。

1.2.3 HgC12标准曲线制作［11］

用3%NaCl作稀释液，配制2mg／L HgCl2溶液，用50ml容量瓶稀释成0.04mg／L、0.08mg／L、0.12mg／L、0.16mg／L、0.20mg／L、0.24mg／L。HgCl2溶液各浓度设3个平行，每溶液瓶中各加2m1已培养好的菌液，同时在3个对应平行对照（ck）加3%NaC1 2m1。

相对发光度是由HgCl2各浓度与相对应（ck）测得发光量相比求出的平均值。

建立HgCl2浓度（c）与相对发光度（T）的相关方程：T＝a＋bcHgC12，并通过查相关系数显著水平（P值表），检验所求值的显著水平P＜0.01，说明EC50HgCl2＝0.10±0.02mg／L所求的方程成立，反之，不成立。

1.2.4 样品检验与评价

每个样品设平行3个测试瓶。每瓶加2m1培养好的菌液的，每个样品设对应3个平行对照（ck），每个对照瓶加3%NaCl溶液2ml.

根据HgCl2工作曲线测定的方法进行测定相对发光度，对计算结果利用origin7.5软件进行线性拟合，建立并检验各试验浓度（（c）与相对发光度（T）的相关方程：T＝a＋bc，根据方程求出EC50值［13］，根据EC50值判断样品的毒性。

2 结果与分析

2.1 检测方法准确性验证

根据测定的相对发光度制作HgCl2工作曲线，建立并检验各试验浓度（（c）与相对发光度（T）的相关方程：T＝a＋bc，根据方程求出EC50值，见图1。

图1 T3菌发光度的Hg Cl2检测曲线Fig.1Hg curve of T3bacteria luminosity

从测试结果来看，HgCl2浓度系列通过建立相关方程及相关性显著性检验，P＝0.0024，明显小于0.01，表明其非常显著的相关性，相关方程成立。且 15min－EC50HgCl2值基本保持在 0.10±0.02mg／L范围内，符合方法的两项指标要求，说明本次发光菌测试结果是准确可信的。在测定中，我们注意到发光细菌发光强度在反应前1min有所上升，可能是反应初始菌液瞬时被稀释而使发生强度有所升高。然后在HgCl2毒性作用下，发光菌发光强度随时间而不断下降，2—5min范围内降幅较小，每1min降幅值约为初始值的2%，且逐渐增加；在6—13min范围内降幅最大，每1min降幅可达初始值的5%，后期降幅减少；在14—17min范围内，降幅与2—5min范围内的降幅相似；18—23min范围内降速变得更缓慢，30min后趋于平稳。这可能是因为HgCl2毒性使细菌荧光素酶失活，从而抑制了细菌细胞发光反应，造成发光强度逐渐下降，但在此毒性浓度内，对细菌不会致死，而细胞通过 “应激”作用而使发光强度降速逐渐减缓［14］，实验与文献［15］结果较为吻合。

2.2 聚合氯化铝对发光细菌发光强度的影响

通过实验建立T3菌发光度与PAC相关曲线如图2，检验各试验浓度（（c）与相对发光度（T）的相关方程：T＝a＋bc，P＜0.001，表明其非常显著的相关性，相关方程成立。在实验中，当聚合氯化铝浓度为1000—2000mg／L时相对发光强度保持在97%—99%间，对发光细菌发光强度无多大影响。当聚合氯化铝浓度达4000mg／L时，对发光细菌发光强度产生显著影响，且发光细菌发光强度随聚合氯化铝浓度的升高而逐渐减弱，测定其相对发光强度降低50%时，聚合氯化铝的15min－EC50值为10200mg／L，与文献［16］的实验结果较为接近。

图2 T3菌发光度与PAC相关曲线Fig.2T3bacteria luminosity curve with the PAC

2.3 聚丙烯酰胺对发光细菌发光强度的影响

通过实验建立T3菌发光度与PAM相关曲线如图3，检验各试验浓度（（c）与相对发光度（T）的相关方程：T＝a＋bc，P＜0.001，表明其非常显著的相关性，相关方程成立。实验发现聚丙烯酰胺浓度为2000—4000mg／L时其相对发光强度变化很小，均保持在96%以上，当聚丙烯酰胺浓度6000mg／L时对发光细菌发光强度产生比较显著的影响，且发光细菌发光强度随聚丙烯酰胺浓度的升高而逐渐减弱，这可能与聚丙烯酰胺的性质有关，本身是非危险品，无毒、无味、无腐蚀性，但可能与其在水中降解产生单体丙烯酰胺（AM），而单体的丙烯酰胺具有很大毒性，会对人和动物周围神经系统产生永久的、不可修复的损害［17］，聚丙烯酰胺浓度较低时，丙烯酰胺单体成分少，不至于对发光菌产生影响，但随聚丙烯酰胺浓度的升高，其单体成分增加，对发光细菌的影响也就越大。测定其相对发光强度降低50% 时，聚丙烯酰胺的 15min－EC50值为17200mg／L。

图3 T3菌发光度与PAM相关曲线Fig.3T3bacteria luminosity curve with the PAM

2.4 壳聚糖对发光细菌发光强度的影响

通过实验建立T3菌发光度与壳聚糖相关曲线如图4，检验各试验浓度（（c）与相对发光度（T）的相关方程：T＝a＋bc，P＜0.001，表明其非常显著的相关性，相关方程成立。实验发现壳聚糖浓度为40000—80000mg／L时其相对发光强度变化很小，均保持在98%以上，实验测定其相对发光强度降低50%时，聚丙烯酰胺的 15min－EC50值 为169400mg／L。

图4 T3菌发光度与壳聚糖相关曲线Fig.4 T3bacteria luminosity curve with chitosan

在壳聚糖相对发光度的试验中，发现了壳聚糖的相对发光度大于1，说明了壳聚糖对发光细菌具有一定的活化作用，与文献［18］研究相同。但实验表明，其相对发光度与其浓度间呈现一定的负相关性，说明壳聚糖对发光细菌同时具有一定的毒性作用，且其毒性因素随样品浓度的增大而增加，其毒性或许与纯度、浓度、操作及发光菌自身因素等有一定的关系，其毒性的影响有待进一步的实验去探讨。但对于做为絮凝剂来说，其使用量能保证安全的需要。

3 结 论

通过毒性 （MTX）实验表明：聚合氯化铝的15min－EC50值（细菌发光半数抑制剂量）为10200mg／L，聚丙烯酰胺的 15min－EC50值 为17200mg／L、壳聚糖的15min－EC50值为169400mg／L。由于在水处理中，聚合氯化铝、聚丙烯酰胺、壳聚糖使用的浓度较低下，其在水溶液中所形成的浓度不足以对发光细菌产生毒性效应，因此三种絮凝剂均可以用于混凝好氧颗粒污泥培养的应用。

［1］Mishima K，Nakamura M.Self－immobilization of aerobic activated sludge a pilot study of the process in municipal sewage treatment［J］.Water Sci Technol.；1991，23（4）：981－990

［2］宋雪松，刘永军，刘 喆，等.混凝强化形成好氧颗粒污泥［J］.环境工程学报，2014，8（3）：929－934

［3］徐红霞，刘永军，宋雪松，等.混凝强化造粒条件下好氧颗粒污泥的去污特性［J］.安全与环境，2014，14（1）：182－186

［4］张驰，刘永军，刘喆，等.混凝强化造粒条件下好氧颗粒污泥中微生物的繁衍与聚集［J］.水土保持学报，2013，27（5）：214－218

［5］易诚，湛含辉，陈津端，等.搅拌－序批式活性污泥反应器（WSBR）中好氧颗粒污泥的特性研究［J］.环境科学学报，2011，31（2）：268－275

［6］易诚，湛含辉，陈津端，等.WSBR培养好氧颗粒污泥的试验研究［J］.中国矿业大学学报，2012，41（2）：327－333

［7］吴泳标，张国霞，许玫英，等.发光细菌在水环境生物毒性检测中应用的研究进展［J］.微生物学通报，2010，37（8）：1222－1226

［8］朱丽娜，刘瑞志，夏建新，等.发光细菌法测定水质综合毒性研究进展［J］.中央民族大学学报：自然科学版，2011，20（4）：14－20

［9］易诚，湛含辉，程胜高.混凝好氧颗粒污泥的絮凝剂选择［J］.环境工程学报，2014，8（10）：4097－4013

［10］国家环境保护总局，国家技术监督局.水质急性毒性的测定发光细菌法［M］.北京：中国标准出版社，1996：1－7

［11］马文猗 ，杨柳燕.环境微生物工程［M］.南京：南京大学出版社，1998：104－108

［12］李秀珍，李斌莲，范俊欣，等.油田化学剂和钻井液生物毒性检测新方法及毒性分级标准研究［J］.钻井液与完井液，2004，21（6）：44－46，82

［13］农永光，胡刚.发光细菌法在国内水质监测中的应用［J］.分析仪器，2012（1）：79－81

［14］黄正，汪亚洲，王家玲.细菌发光传感器在快速检测污染物急性毒性中的应用［J］.环境科学，1997，18（4）：14－17

［15］张金丽，袁建军，郑天凌，等.Microtox技术检测多环芳烃生物毒性的研究［J］.中国生态农业学报，2004，12（4）：68－71

［16］丘丰，胡怡秀，臧雪冰，等.三种净水剂的毒性研究［J］.实用预防医学，1999，6（4）：316

［17］Sathesh C P，Thatheyus A J.Biodegradation of acrylamide employing free and immobilized cells of Pseudomonas aeruginosa［J］.International Biodeterioration ＆Biodegradation，2007，60：69－73

［18］田昆仑，李东红，刘良明，等.壳聚糖及其水溶性衍生物的细胞毒性研究［J］.现代临床医学生物工程学杂志，2002，8（6）：422－423，426