藏药吉子恩保(甘西鼠尾草)DNA提取方法比较

李文渊，王津慧，童 丽，杨 靖，热增才旦，索南邓登，杨 芳

(青海大学 医学院，青海 西宁 810001)



藏药吉子恩保(甘西鼠尾草)DNA提取方法比较

李文渊，王津慧，童 丽，杨 靖，热增才旦，索南邓登，杨 芳

(青海大学 医学院，青海 西宁 810001)

目的：建立藏药吉子恩保(甘西鼠尾草)DNA的提取方法，为进一步开展分子生药学研究奠定基础。方法：比较SDS法和改良CTAB法，运用紫外分光光度计和电泳分析方法测定所得DNA样品的纯度和浓度。结果与结论：两种方法中改良CTAB法所得的DNA质量较高。

吉子恩保；甘西鼠尾草；DNA提取

甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim.)(药材名：甘肃丹参)为唇形科鼠尾草属植物，藏药名吉子恩保(音译)，与大宗常用中药丹参为同科植物，其有效成分与中药丹参相似，功能主治亦与丹参相同，在西南、西北地区甘西鼠尾草普遍作为临床治疗心血管疾病中药丹参的替代品种[1]。早在20世纪80年代，科研工作者就展开了鼠尾草属植物的筛选工作，在“七五”国家重点科技攻关项目“丹参类专题研究”中得出结论：综合比较测定结果，以甘西鼠尾的有效成分含量高，药理作用最强，质量最好，植物资源丰富，且已有商品在全国流通，值得推广应用[2]。

此外，甘西鼠尾草作为丹参药材的重要资源之一，有文献报道其品质甚至超过正品丹参，但目前对于其开发利用力度远远不够，研究多集中于有效成分含量测定[3]、简单药理作用[4]、资源调查之类[5]，用分子生物学方法对其遗传多样性、资源评价、分子标记等方面的研究论文甚少。高质量的DNA是开展上述工作的前提，本文拟研究获得高质量甘西鼠尾草DNA的实验方法，为开展后续分子生药学[6]研究奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 材料

甘西鼠尾草材料分别采自青海省黄南藏族自治州、甘肃武威市、甘肃省甘南州、青海省互助县，见表1。样品经青海大学医学院药学系王津慧教授鉴定为甘西鼠尾草。硅胶快速干燥后置于-20℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(国药集团)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(Solarbio)、β-巯基乙醇(AMRESCO)、EDTA(国药集团)、SDS(国药集团)、溴化乙锭(EB)(Sigma)、琼脂糖(GENETECH)，其它试剂为国产分析纯。

1.3 主要仪器

冷冻离心机(Eppendorf)、紫外可见分光光度计(上海精科)、 凝胶成像系统(Tanon)、电泳仪( 北京市六一仪器厂)、水浴锅( 东方电工)。

表1 供试材料信息

2 方法

2.1 SDS法

称取甘西鼠尾草干燥材料0.3g，置于液氮研磨成粉，加入SDS抽提缓冲液(100mmol/LTris-HCl(PH8.0)、50mmol/L EDTA(PH8.0)、50mmol/L NaCl、10mmol/L β-巯基乙醇900μL和10%SDS 100μL，反复摇匀，于65℃水浴1h。12 000r/min离心10min，取上清液。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)摇匀，12 000r/min离心10min，取上层溶液，加入2/3倍体积的冷异丙醇，摇匀，放入-20℃冰箱中，30min。离心12 000r/min，5min，倒掉溶液，加入70%乙醇洗涤2次最后将沉淀溶于50μL ddH2O中。

2.2 改良CTAB法

称取甘西鼠尾草干燥材料0.3g，经液氮冷冻后研磨成粉末状,立即转入65℃预热后的900μLCTAB提取缓冲液(2%CTAB,疏基乙醇)中,充分振摇使材料与提取液混合均匀，于65℃保温90min,其间轻轻倒转离心管数次,冷却至室温,加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提,摇匀5～10min,静置分相,4℃离心(10 000r/min,10min),将上清液转入另一离心管中,重复以上步骤至两相分界明显,取上清液加入新的1.5mL离心管中,加入500μL纯异丙醇(-20℃冷冻)。沉降DNA,轻轻颠倒2～3次,可见白色絮状沉淀,-20℃冰箱中静置15min,离心(12 000r/min，10min)。加入500μL75%乙醇洗涤1次,纯乙醇洗涤1次, 12 000r/min离心5min，倒掉洗液，通风橱吹干约1h，待总DNA干燥后,加入50μL ddH2O。

2.3 DNA质量检测

将DNA提取液稀释100倍后，用紫外分光光度计观测在紫外光260nm和280nm处的吸收值A260、A280，并以A260/A280的比值鉴定纯度。DNA浓度(ng/μL)=A260×50μg×稀释倍数，结果见表2。采用1.5%琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统观察并拍照，见图1。

表2 不同提取方法DNA质量比较

图1 不同提取方法DNA凝胶电泳

3 讨论

植物基因组DNA质量的好坏决定后续PCR实验的成败，因此，植物基因组DNA的提取是分子生药学实验的一个重要环节。本实验以藏药吉子恩保的原植物甘西鼠尾草经硅胶快速干燥的新鲜叶片作为供试品材料，提取DNA作为后续PCR反应的模板，根据文献报道，本实验尝试用步骤较为简便的改良CTAB法和SDS法分别进行DNA的提取。由表2可知，用SDS法提取的DNA得率普遍较高，但是A260/A280比值多低于1.8，说明提取的DNA样品中存在蛋白质或多酚污染；用改良CTAB法提取的DNA得率较低，但A260/A280比值在1.8左右，说明DNA的纯度较高。如图1所示，用SDS法提取的DNA点样孔能看到明显的亮光，说明样品中含有未去除的蛋白质。

在提取过程中，用改良CTAB法提取的DNA颜色呈乳白至透明状，但用SDS法提取的DNA颜色普遍较深，呈棕色至深棕色，可能是甘西鼠尾草中酚类及糖类杂质未被除尽。综合考虑，虽然CTAB法比SDS法提取的DNA得率低，但是高纯度的DNA才是本实验的目的，因此在这两种方法中，改良CTAB法是较为理想的提取方法，其它提取方法的发掘，还有待进一步研究。

[1] 翁裕馨，李成义.中藏药材甘西鼠尾草的研究进展[J].中国民族民间医药，2010,19(3):19.

[2] JIAN YH.Special Study on Plants of Radix Salviae Miltiorrhizae Variety Sort and Qulity Control of Common Chinese Medicinal Materials[M].Fuzhou: Fujian Science and Technology Publishing House, 1994.

[3] 杨立新，李杏翠，刘超灯，等.甘西鼠尾草中化学成分研究[J].药学学报，2011,46(7)：818.

[4] 王利彦，王津慧，吕慧玲，等.甘西鼠尾草的抗缺氧研究[J].四川中医，2009,27(4)：43.

[5] 李旻辉，宋晓玲,肖培根，等. 中国鼠尾草属植物传统药物学的调查[J].时珍国医国药，2011,22(2)：476.

[6] 黄璐琦.分子生药学[M].北京：北京医科大学出版社，2006.

(责任编辑：魏 晓)

Comparative Study of Methods for Isolation of Total DNA from Tibetan Medicine Jizi-Enbao(SalviaPrzewalskiiMaxim.)

Li Wenyuan，Wang Jinhui，Tong Li，Yang Jing，Rezeng-Caidan，Suonan-Dengdeng，Yang Fang

(Medical College of Qinghai University, Xining 810001，China)

Objective:To obtain a method for yielding DNA from tibetan medicine Jizi-Enbao(Salvia przewalskii Maxim.), which lie a foundation for further molecular experiments.Methods:Two different DNA extraction protocols, SDS protocol, and the improved CTAB protocol, were examined and compared. The purity and concentration of DNA were detected by UV spectrophotometric analysising and agarose gel electrophoresis testing.Results and Conclusion:The DNA isolated by improved CTAB protocol was with high quality in two different DNA extraction protocols.

Jizi-Enbao;SalviaprzewalskiiMaxim; DNA extraction

2014-11-14

青海省科技厅项目(2011-N-F19)；青海大学中青年科研基金(2012-QYT-1)

李文渊(1983-)，女，硕士，青海大学讲师，研究方向为中藏药资源研究。

R285.5

A

1673-2197(2015)07-0011-02

10.11954/ytctyy.201507005