黏液性铜绿假单胞菌的耐药性分析

李晓燕　赵杰　赵丽雅　郝雪涛　许娜娜

黏液性铜绿假单胞菌的耐药性分析

李晓燕赵杰赵丽雅郝雪涛许娜娜

【摘要】目的分析铜绿假单胞菌(PAE)对抗菌药物的耐药情况，为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法应用K-B法分别测试110株黏液型和110株非黏液型铜绿假单胞菌对常用的13种抗菌药物的敏感性，并进行统计分析。结果黏液型铜绿假单胞菌对美洛培南、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、庆大霉素的敏感率明显高于黏液型铜绿假单胞菌，差异有统计学意义(P＜0.05)，对亚胺培南、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、环丙沙星、氨曲南、左氧沙星的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05)。结论黏液型PA体外药敏试验耐药性较低，但体内用药治疗效果不佳，而使用体外药敏试验敏感药物与能抑制细菌表面生物膜作用的药物联合使用，治疗效果较为明显。

【关键词】黏液型铜绿假单胞菌;耐药性;生物膜;抗菌药物

作者单位: 056001河北省邯郸市中心医院检验科

近年来，铜绿假单胞菌(PAE)感染增多，且治疗十分棘手，常出现药敏试验结果与临床治疗不一致的现象，其原因之一是生物膜的形成。铜绿假单胞菌根据菌落形态及是否产生大量藻酸盐，可将PAE黏液型和非黏液型2个型别［1］。黏液型PAE极易吸附于导管、黏膜表面形成生物膜，引起临床难治性感染［2］。现对我院分离的110株黏液型PAE和110株非黏液型PAE进行药敏分析，并进一步探讨大环内酯类与喹诺酮类药物联合运用对黏液型PAE的治疗效果，为临床提供更可靠有利的药敏结果。

1　材料与方法

1.1实验材料选取2011年6月至2013年5月河北省邯郸市中心医院住院患者的痰标本，从标本中共分离的黏液型和非黏液型PAE各110株，同一患者多次分离到的菌株不重复计入。

1.2试剂所有菌株经常规分离培养后，用梅里艾厂家提供的Vitec2及配套GN鉴定板进行菌株鉴定。血平板及中国兰平板由天津金章公司提供，药敏纸片购自英国Oxoid公司，药敏纸片包括亚胺培南、美洛培南、阿米卡星、妥布霉素、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星、环丙沙星、头孢曲松、庆大霉素、氨曲南。

1.3菌株分离与鉴定标本培养、分离严格按照《全国临床检验操作程序》第3版进行。

1.3.1黏液性PAE的菌落形态:经35℃培养18～24 h，粘液性铜绿在血板上生长为无色、小露滴样、边

缘不规则、不溶血小菌落、48 h长大而融合、粘稠、胶冻样菌落、溶血不典型、可有可无。用接种环挑起无金属光泽、无特殊气味的菌落，分纯后经过法国梅里艾VITEK2Compact鉴定为PAE，判定为黏液型PAE。

1.3.2非黏液型PAE的菌落形态:经35℃培养18～24 h，黏液型铜绿在血板上生长为大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色、透明溶血环的菌落、有生姜味。分纯后经过法国梅里艾VITEK2Compact鉴定为铜绿假单胞菌，判定为非黏液型PAE。

1.4药敏试验与结果判读用标准浓度纸片法(Kirby-Bauer)法对13种常用抗生素做敏感性试验。使用铜绿假单胞菌ATCC27853进行质控。非黏液型铜绿假单胞菌采用24 h的结果判读。因为黏液型铜绿假单胞菌生长缓慢，常规24 h在MH板上判读会造成假阴性，所以采用培养48 h的结果，或是血MH板24 h判读(因为该菌在血MH上生长良好)，判读按照美国临床实验室标准委员会2011年的标准进行。

1.5统计学分析计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌耐药性分析中介纳入敏感合计为敏感株，黏液型PAE对美洛培南、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、庆大霉素的敏感率高于非黏液型PAE，差异有统计学意义(P＜0.05)，对亚胺培南、阿米卡星、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、环丙沙星、氨曲南、左氧沙星的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2黏液型PAE的治疗效果110株黏液型PAE随机分为2组。其中一组单用表1药敏结果(左氧沙星)进行抗菌药物治疗(对照组)，另一组用左氧沙星与

表1　黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌对13种抗菌药物敏感性比较　种(%)

大环内酯类药物联用治疗(试验组)，这2组都治疗2周后复检，再次复检没有培养出黏液型PAE的为治疗有效，培养出黏液型PAE的为治疗无效。2组治疗黏液型PAE有效率不等，差异有统计学意义(χ2=42.9，P＜0.05)。见表2。

表2　2组治疗黏液型PAE有效率的比较

3　讨论

PAE是假单胞菌属中最为常见的致病菌之一，近年来，PAE在医院的分离率一直居高不下，且耐药性强、难以根除，已成为临床治疗的难点［3］。

其耐药的原因主要有以下几个方面: (1)产生多种灭活酶或钝化酶，如Ampe酶、超广谱B一内酰胺酶和金属酶; (2)基因的突变，如DNA拓扑异构酶及DNA回旋酶突变，膜的通透性下降，主动外排泵系统的过量表达; (3)生物被膜，细菌生物被膜(biofilm)在PAE感染中广泛存在，是导致抗菌治疗失败的重要原因之一; (4) DNA错配修复系统，PAE的耐药机制极为复杂，它对某一类抗菌药物的耐药常是几种机制协同作用;它对不同抗菌药物的耐药机制也不完全相同，而且还不断有新的耐药机制出现［4］。

从附表1可以看出，黏液型PAE的体外敏感抗生素较多，耐药性较弱，且弱于非黏液型PAE的耐药性。这表明在不考虑，黏液型PAE形成生物膜的情况下，选用抗生素的范围要比非，黏液型PAE广得多。黏液型PAE是PAE在自然界中存在的一种特殊形式，非黏液型PAE在一定的条件下可转化成黏液型PAE，其表面存在大量以多糖藻酸盐为主要成分的粘液，从而可形成生物膜［5，6］。藻酸盐是黏液型铜绿假单胞菌形成生物被膜的主要成分，可以使其能够免于被药物清除，造成其长期定值［7］，造成慢性、反复性感染，同时也会造成药敏试验结果与临床治疗效果不相符合，给用药带来困难。体外研究发现，藻酸盐在，黏液型PAE生物被膜的形成中发挥着重要的作用，所以除去生物被膜必须设法减少藻酸盐的合成。

从表2我们可以明显的看出联合用药的治疗效果明显优于单一用药。按药敏结果来看，左氧可以用于治疗黏液型PAE的经验治疗药物，可是从表2中看出左氧治疗黏液型PAE的效果相当的不好，治愈率仅为14.55%(8/55)。所以在治疗黏液型PAE时必须考虑其生物被膜的影响。而第二组用左氧沙星与大环内酯类药物联用大大提高了其杀菌效果，55例患者经联合用药治疗2周后，有44例均有不同程度的好转，其微生物检查结果:未检出黏液型PAE。其治愈率为80.00%(44/55)。

PAE生物膜的主要成分是胞外黏多糖，而黏多糖的主要成分是藻酸盐。大环内酯类抗生素通过抑制藻酸盐生物合成途径中的二磷酸甘露糖脱氢酶(GMD)活性［8］，减少藻酸盐合成，从而破坏黏液型PAE表面的生物膜，降低细菌的黏附性，使敏感药物的治疗效果明显增强。有研究表明，部分大环内酯类抗菌药物如阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素等能有效减低生物被膜的抵抗作用，与体外敏感药物联合运用，能使敏感药物容易穿过被膜屏障接触到菌体，提高杀菌效果［9－11］，延长患者的生命。笔者在左氧沙星与大环内酯类药物体外联合药敏试验中得出，两药联用后的抗菌活性有很大程度地提高。

虽然左氧沙星与大环内酯类药物联联用于PAE等细菌生物被膜可以起到一定的增效作用，但尚未完全杀灭被膜下细菌。

黏液型PAE被膜的产生有多方面的原因，大量抗菌药物的应用及内置管道等都易诱发生物膜的产生，临床应加强加大抗菌药物的监管和应用，减少黏液型PAE引起的院内感染，监测抗菌药物对黏液型PAE的耐药性变化，及时为临床提供抗菌药物的耐药性变化，指导临床用药。临床医师在治疗黏液型PAE引起的感染时，应根据病原菌特点结合药敏结果合理选用抗菌药物。另外，在抗菌药物治疗过程中，铜绿假单胞菌治疗3～4 d后即可能发生耐药，所以患者在治疗过程中，应随时监测抗生素的敏感性变化，调整治疗方案，提高治疗效果。

参考文献

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11王胜，陈素梅，刘东声，等.黏液型铜绿假单胞菌药敏分析及对策.中华医院感染学杂志，2013，23: 1941-1942.

(收稿日期:2014－10－23)

通讯作者:赵杰，056001河北省邯郸市中心医院检验科; E-mail: zjlxy1208@ sina.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.048

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1247－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 378.991