microRNA-1对急性心肌梗死的早期诊断价值研究*

田志鹏，孟亮，杨帆，李立杰，王微

（沈阳医学院附属中心医院 循环内科，辽宁 沈阳110024）

MicroRNA（简称miRNA）是一类生物进化上高度保守、长度为21～26个核苷酸的非编码核苷酸的单链小分子RNA，在生物进化过程中高度保守，其并不编码蛋白质，但通过对基因表达、蛋白质翻译及靶RNA稳定性的调控，参与到许多重要的生物过程中。研究发现miRNA在心血管疾病发生、发展过程中起到重要作用，使miRNA成为心血管研究领域的热点。国外研究表明，miRNA-1在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者外周血中明显增高，可能成为诊断AMI新的生化标记物[1-3]。

急性心肌梗死是一种发病迅速、死亡率高的常见病，部分心肌梗死的早期症状不典型，心电图表现不明显。为了降低AMI的死亡率，急切需要一种早期且更加特异的诊断AMI的新型的生化标记物。本研究采用实时定量PCR方法，通过检测急性心肌梗死患者和健康人群血清中MicroRNA-1（简称miR-1）表达量的差异，探讨血清miR-1作为急性心肌梗死早期诊断生化标记物的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 心肌梗死组患者 选择2012年10月-2013年12月沈阳医学院附属中心医院循环内科收治的急性心肌梗死患者49例。入选标准：心肌梗死患者参照2010年心肌梗死诊断指南。心脏生物标志物至少有1次数值超过参考值上限的99百分位（即正常上限），并有以下至少1项心肌缺血的证据：①心肌缺血临床症状；②心电图出现新的心肌缺血变化，即新的ST段改变或左束支传导阻滞；③心电图出现病理性Q波；④影像学证据显示新的心肌活力丧失或区域性室壁运动异常。排除标准：并发其他脏器功能衰竭或严重病变（如肺癌、肝和肾功能衰竭等）及过敏性疾病和自身免疫性疾病的患者除外。

1.1.2 健康组入选标准 无心血管病史，心电图、胸片、肝肾功能和生化常规检查正常，排除合并感染和肿瘤等。

1.1.3 采血时间 所有患者（包括疑是心肌梗死患者）入院后即留取血液样本，之后根据入选标准中2010年急性心肌梗死诊断指南，符合急性心肌梗死诊断标准则入选本实验。以心肌梗死典型症状出现作为0点，每次采血时间与心肌梗死典型症状出现时间间隔确定为此次采血时间段。入院时间（首次采血时间）在心肌梗死典型症状发作后8 h内则入选本研究，在8 h以上则剔除入选本研究。除了T0以后所有的时间点，在每一个患者都是按照试验预定时间采血。此研究符合人体试验委员会制定的伦理标准，所有受试对象均知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 在心肌梗死发作后的不同时间段收集全血标本（4ml×2）。T0：AMI患者入院时（4.98±2.46）h；T8：AMI发病8 h（8.00±0.50）h；T12：AMI发病12 h（12.00±0.50）h；T24：AMI发病24 h（24.00±0.50）h；7 d：AMI发病后第7天；14 d：AMI发病后第14天。其中一份用于提取全血RNA，另一份血液标本离心机（Sigma公司）离心10 min（1 000 r/min），吸取上清液，用于检测肌钙蛋白I（troponin I，cT nI）。血浆与全血标本均保存于-80℃冰箱（Thermo公司）中。

1.2.2 ELISA法检测血浆cTnI的表达 根据ELISA（Abnova，台湾）试剂说明书检测样本中cTnI的表达量。

1.2.3 RNA分离及实时定量PCR（qRT-PCR）Trizol提取全血总RNA（Invitrogen，CA）。取2μg总RNA根据M-MLV逆转录酶逆转录合成cDNA（Promega，WI），选用U6作为内参。逆转录引物序列如下：miR-1 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGA GTCGGCAATTGCACTGGATACGACTACATAC-3'；U6：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。应用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（Biosystems，CA），ABI7000实时定量PCR仪（Biosystems，CA）进行逆转录（具体操作步骤见说明书）。RT-PCR反应引物序列如下：miR-1上游引物序列5'-GGGGTG GAATGTAAAGAA-3'，下游引物序列5'-TGCGTGTC GTGGAGTC-3'；U6：上游引物序列5'-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列5'-CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每个样本均设复孔。反应体系95℃孵育30 s后开始循环程序：变性95℃，15 s，退火60℃，60 s，延伸60℃，60 s共40个循环。实验数据使用ABI 7000软件进行分析，将qRT-PCR中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（Ct值）作为样本表达量标准。应用2-△△Ct方法计算miR-1的相对表达水平，所有数据进行log2转换后进行统计分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计量数据用方差齐性检验以及t检验，两两间比较用χ2检验。应用ROC曲线来判定miR-1对急性心肌梗死的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入选对象的基线特征

AMI组患者49例，对照组49例，各组入选对象年龄、性别、吸烟人数、心率（heart rate，HR）、收缩压（systolic blood pressure，SBP） 和 舒 张 压（diastolic blood pressure，DBP）基线特征差异无统计学意义（P>0.05）。见附表。

2.2 全血m iR-1在急性心肌梗死发病不同时间的表达量

图1为全血miR-1相对表达水平，miR-1的相对表达量用log2miR表达率表示，其值越低，miR表达量越高。全血miR-1在急性心肌梗死发病后的表达量都较对照组增高，在T0[入院时（4.98±2.46）h]、T8[AMI发病8 h，（8.00±0.50）h]、T12[AMI发病12 h，（12.00±0.50）h]和T24[AMI发病24 h，（24.00±0.50）h]时间，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 全血m iR-1相对表达水平

附表 入选病例基线特征 （n=19，±s）

附表 入选病例基线特征 （n=19，±s）

组别 年龄/岁 男性/［例（%）］ 吸烟人数/［例（%）］高血压/［例（%）］高脂血症/［例（%）］糖尿病/［例（%）］ HR/（次/min） SBP/mmHg AMI组 52.11±11.42 28（57.1） 27（55.1） 20（40.8） 27（55.1） 18（36.7） 86.28±10.16 133.47±5.84对照组 53.08±8.70 27（55.1） 24（49.0） 15（30.6） 20（40.8） 14（28.6） 81.89±9.05 131.86±5.01 P值 0.850 0.841 0.549 0.297 0.160 0.394 0.342 0.498

续附表

2.3 在急性心肌梗死发病不同时间全血m iR-1与cTn I表达量的对比

在全血miR-1相对表达水平与血浆cTnI表达水平的对比图（见图2）中可以看出，全血miR-1在AMI患者入院时即开始增高，在发病8 h达峰值，T24之后有所下降，7 d降至正常范围；cTnI在AMI患者入院时即开始增高，在发病24 h达峰值，T24之后有所下降，7 d降至正常范围。miR-1与cTnI比较具有更早的达峰值时间。

2.4 血清m iR-1预测AMI的评估

血清miR-1的ROC曲线下面积（AUC）在T0（A）、T12（B）和T24（C）分别为0.888（95%置信区间CI：0.812～0.964，P=0.001）、0.906（95%置信区间CI：0.839～0.974，P=0.001）和0.838（95%置信区间CI：0.745～0.931，P=0.001）。结果提示血清miR-1诊断AMI具有较高的敏感性和特异性。见图3。

图2 全血m iR-1相对表达水平与血浆cTn I表达水平

图3 血清m iR-1诊断价值的评估

3 讨论

部分AMI患者的早期症状不典型，心电图表现不明显，如何尽早诊断AMI一直是困扰临床医生的难题之一。目前用于诊断AMI的生化指标主要有肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T和肌红蛋白等，但它们早期诊断AMI却不很理想，肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T缺乏早期敏感性；肌红蛋白对骨骼肌和心肌损伤不能区分，缺乏特异性。所以急切需要一种早期，更加特异的诊断AMI的新型的生化标记物。

miRNA是近年来新发现的一类非编码RNA，在抑制转录后基因表达和促进靶mRNA降解的过程中起重要的负性调节作用，可以在转录后水平调控蛋白的表达，具有调控细胞增殖、分化和凋亡等生物学功能。迄今在心肌细胞中已发现数十种miRNA，如microRNA-1、microRNA-21、microRNA-133和micro RNA-195等，它们参与了多种心血管疾病的发生发展。最近的研究发现，循环中的miRNA与心肌损伤密切联系。在AMI早期1～2 h即可测得miRNA改变[4-7]，而且miRNA具有细胞特异性和在血浆、血清和尿液中的稳定性，正在逐渐成为诊断AMI的一种新型的生化标记物。目前国外有关miRNA在AMI早期诊断中应用的研究结果表明[8-11]，miRNA与传统的生化指标相比较，在时效性、敏感性和特异性上具有综合优势，是一种新的、有重要价值的AMI诊断指标。

miR-1是肌肉及心肌组织中富含的一种miRNA。CHENG等[12]在Triton X-100体外诱导的心肌坏死模型中发现，miR-1能释放入培养液中，且能稳定存在至少24 h。D'ALESSANDRA等[13]的研究发现心肌梗死患者循环中的miR-1的上调与cTnI水平相关，具有相同的峰值时间。提示miR-1可能作为AMI新的生化标记物。本研究发现全血miR-1在急性心肌梗死发病后的表达量增高，在T0、T8、T12和T24均明显高于对照组（P<0.05）。这与国外研究结果相一致。

本研究结果提示miR-1在AMI患者发病8 h达峰值，而cTnI在AMI患者发病24 h达峰值，说明miR-1具有早期诊断AMI的优势。miR-1的ROC曲线下面积在T12为0.906，提示miR-1诊断AMI具有较高的敏感性和特异性。本研究提示未来血清miR-1可能成为急性心肌梗死早期诊断的新的生化标记物。

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