益气温阳活血方含药血清对肥大心肌细胞β3-肾上腺素能受体的影响研究*

王里，顾广富，罗建华，杨冬花

（1.贵州省人民医院 干部医疗科，贵州 贵阳550002；2.贵阳中医学院,贵州 贵阳550025）

心力衰竭时交感神经系统激活，机体分泌大量去甲肾上腺素（NE），诱导心肌细胞β-肾上腺素能受体表达变化，参与心肌重塑的病理生理过程[1]，抑制交感神经兴奋，已成为治疗心力衰竭的重要作用靶点。笔者研究发现，益气温阳活血方可降低心力衰竭大鼠内皮素-1、一氧化氮、一氧化氮合酶的水平，阻断钙调磷酸神经激酶信号通路活化，抑制心肌重塑[2-3]，但是否能通过抑制交感神经兴奋防止心肌肥大，目前尚不清楚。本研究通过观察益气温阳活血方对肥大心肌细胞NE、β3-肾上腺素能受体（β3-AR）表达的影响，为进一步临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康Wistar大鼠30只，体重（250±10）g，雌雄各半；Wistar乳鼠40只，新生2 d左右，雌雄不拘，由贵阳医学院实验动物学部提供。

1.1.2 益气温阳活血方组成 人参30 g，黄芪30 g，桂枝9 g，丹参30 g，益母草30 g，红花6 g，白术15g，泽泻9 g，茯苓15 g，葶苈子9 g，炙甘草6 g，共11味中药，药材购自贵州省人民医院中药房，生药按比例取好，加水浸泡60min，第1遍煮沸40min，滤渣取汁，再加水煮沸15min，滤渣取汁，合并2次煎液，在水浴中浓缩煎液至含生药4 g/ml，保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 卡维地洛（齐鲁制药有限公司，批号：H20000100），Trizol（Invitroge公司），Rnasin（Promega公司），M-MLV（Promega公司），引物由上海生物工程公司合成，胎牛血清（GIBCO公司），AngⅡ（Sigma公司），1640培养基、胰酶（Sigma公司），NE（RB公 司），MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2（Santa Cruz公司），大鼠Anti-β3-AR抗体（Abcam公司），制胶、电泳及转膜仪（Bio-Rad公司），PCR仪（Eppendorf公司），酶标仪（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 30只Wistar大鼠分为3组：①中药组10只，予益气温阳活血方（8m l/kg）灌胃治疗；②卡维地洛组10只予卡维地洛[50mg/kg+蒸馏水（8ml/kg）]灌胃治疗；③空白血清组10只予蒸馏水（8ml/kg）灌胃。3组动物给药2次/d，共8周。末次灌胃后1 h颈动脉采血处死动物，分离血清。将血清经微孔滤膜灭活、滤菌后与DMEM培养基配成10%浓度。

1.2.2 肥大心肌细胞模型 取新生乳鼠心室肌，用0.25%胰蛋白酶消化分离，经差速纯化2 h，接种于10%血清DMEM培养液中。取上述细胞加入AngⅡ（终浓度10-7mol/L）作用48 h诱导心肌肥大。

1.2.3 实验分组及处理 ①正常组，正常心肌细胞加空白血清培养；②模型组，肥大心肌细胞加空白血清培养；③益气温阳活血方组，肥大心肌细胞加入益气温阳活血方含药血清培养；④卡维地洛组，肥大心肌细胞加卡维地洛含药血清培养。

1.2.43H-亮氨酸掺入量的测定 按上述分组加入不同干预药物同时，在每孔中再加3H-亮氨酸（终浓度为1.85×1011Bq/L），24 h后弃掉培养基，PBS液漂洗，胰蛋白酶消化后收集细胞于玻璃纤维素膜上，三氯乙酸固定。滤膜烘干后置于闪烁瓶中，加入闪烁液，用β-液体闪烁仪测定放射强度。

1.2.5 检 测 细 胞 上 清 NE、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP2含量 72 h后终止细胞培养，将培养板中的培养液吸出，用PBS洗培养物1次，弃去PBS，以ELISA法检测，操作过程参照试剂盒说明书进行。

1.2.6 肥大心肌细胞β3-AR mRNA的表达β3-AR（444 bp）上游引物5'-AGTGGGACTCCTCGT AATG-3'，下游引物5'-CGCTTAGCTACGACGAAC-3'，GAPDH（187 bp）：上游引物5'-GACAACGGCTCC GGCATGTG-3'，下游引物5'-TGAGGATGCCTCTCTT GC-3'。按Trizol试剂说明书提取细胞上清总RNA，参照第一链cDNA合成，试剂盒说明书进行逆转录反应，然后进行PCR反应。取PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳、照相，利用UVP凝胶扫描仪测定条带的吸光度（A）值，以目的基因与GAPDH条带的吸光度（A）值的比值代表其表达的相对量。

1.2.7 肥大心肌细胞β3-AR蛋白质的表达 取细胞上清提取胞浆蛋白，制备聚丙烯酰胺凝胶、蛋白电泳、转膜。一抗浓度均为1∶1 000，二抗浓度为1∶2 000，化学发光试剂法曝光、显影和定影，凝胶成像分析系统进行密度扫描，检测蛋白质表达的相对量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析（one-way，ANVOA），方差齐时，均数的两两比较用LSD法，方差不齐时，均数的两两比较用Tamhane's法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量的测定

模型组心肌细胞MMP-2含量与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显升高（P=0.000、0.000和0.001）；模型组MMP-9含量与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显升高（P=0.000）。模型组TIMP-1含量与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显降低（P=0.000）；模型组TIMP-2含量与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显降低（P=0.006、0.009和0.017）。益气温阳活血方组、卡维地洛组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 心肌细胞3H-亮氨酸掺入量、NE含量、β3-AR m RNA和蛋白质的表达水平检测

模型组心肌细胞3H-亮氨酸掺入量与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显升高（P=0.000）；模型组NE含量与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显升高（P=0.000）；模型组β3-AR mRNA与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较明显升高（P=0.002、0.010和0.007）；模型组β3-AR蛋白质的表达水平与正常组、益气温阳活血方组、卡维地洛组比较均明显升高（P=0.000）。益气温阳活血方组、卡维地洛组心肌细胞3H-亮氨酸掺入量、NE含量、β3-AR mRNA和蛋白质的表达水平与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表1 各组MM-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量比较 （n=10，pg/m l，±s）

表1 各组MM-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量比较 （n=10，pg/m l，±s）

注：1）与模型组比较，P<0.05；2）与正常组比较，P<0.05

组别 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2正常组 51.50±14.151） 119.61±15.011） 76.53±14.951） 55.50±14.981）模型组 76.42±15.562） 159.38±19.292） 45.85±17.292） 37.42±13.852）益气温阳活血方组 52.77±13.391） 124.93±16.901） 75.28±16.411） 54.77±15.531）卡维地洛组 53.06±11.211） 128.52±18.171） 79.34±15.391） 53.06±11.211）

表2 各组3H-亮氨酸掺入量、NE含量、β3-AR m RNA和蛋白质水平比较 （n=10，±s）

表2 各组3H-亮氨酸掺入量、NE含量、β3-AR m RNA和蛋白质水平比较 （n=10，±s）

注：1）与模型组比较，P<0.05；2）与正常组比较，P<0.05

组别 3H-亮氨酸掺入量/cpm NE/（ng/ml） β3-ARmRNA β3-AR蛋白质正常组 1 038.41±190.831） 9.33±2.621） 0.72±0.081） 2.75±0.591）模型组 1 896.94±266.792） 26.72±4.152） 0.84±0.092） 4.65±1.102）益气温阳活血方组 1 085.01±229.541） 10.94±2.241） 0.74±0.061） 2.88±0.641）卡维地洛组 1 111.18±216.061） 9.92±2.071） 0.74±0.081） 2.97±0.601）

心肌细胞β3-AR mRNA表达的琼脂糖电泳图和聚丙烯酰胺凝胶蛋白质电泳图见图1、2。

图1 β3-AR m RNA的表达

图2 β3-AR蛋白质的表达

3 讨论

心肌肥大，主要表现为心肌细胞体积增大、重量及蛋白质合成速率增加，以及基质细胞增生[4]。初期的心肌肥大，可以通过代偿机制改善心脏功能，而长时间心肌肥大导致心肌重塑引起心力衰竭，进而成为心血管疾病发病率和病死率升高的独立危险因素[5]。细胞内促肥大因子与肥大抑制因子间的相互作用决定了细胞是否向着肥大方向发展。金属基质蛋白酶（MMPs）是一组锌离子和钙离子依赖的内源性蛋白水解酶，其主要功能是降解细胞外基质成分，广泛参与体内血管及心肌重塑、炎症损伤、修复器官发育等病理生理过程，金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是MMPs的内源性特异抑制剂，MMPs/TIMPs失衡，在心肌重塑中起着重要作用[6]。

交感神经系统是心血管系统神经体液调节的核心，肾上腺素能受体可识别并与NE特异性结合，将胞外信号转导至细胞内，产生生物学效应，在心力衰竭中起重要作用[7]。β3-AR是近年新发现的β-肾上腺素能受体，参与心脏和血管的生理性调控，其兴奋时不同于β1-AR、β2-AR对儿茶酚胺的正性肌力作用，主要表现为负性变力作用，特别在心力衰竭晚期，持续高表达的β3-AR导致心肌能量代谢障碍[8]、大量炎症细胞因子的表达[9]、心肌细胞凋亡[10]以及通过调节钙离子流产生持续的负性肌力作用，进一步加重心室重塑，恶化心功能[11]。心力衰竭时对β3-AR进行干预不仅可以拮抗负性肌力作用，还能改善心肌细胞能量代谢，延缓细胞凋亡，提高心功能，可能成为心力衰竭治疗的新选择[12]。

本研究结果显示，以血管紧张素Ⅱ刺激乳鼠心肌细胞后，心肌细胞蛋白质合成速率增加，MMP-2、MMP-9含量明显升高，而TIMP-1、TIMP-2含量则明显降低，而且在心肌肥大形成的过程中，同时伴有交感神经持续激活，以心肌细胞NE的分泌增加和β3-AR mRNA和蛋白质表达水平显著升高为主要表现。

卡维地洛是一种具有多种附加作用的第3代β 受体阻滞药，非选择性阻滞β 受体及选择性地阻滞α1受体，为治疗心力衰竭的首选β 受体阻滞剂。研究发现，异丙肾上腺素（ISO）灌流离体大鼠心脏，卡维地洛与特异性的β3-AR抑制剂SR59230A在改善心力衰竭大鼠心功能指标的变化无统计学意义[13]，卡维地洛还能使大鼠衰竭心室、β3-AR mRNA表达明显降低，减轻心室重塑[14]。

中药治疗慢性心力衰竭在控制症状、改善心功能等方面疗效显著，但缺乏客观的、量化的、统一的标准，特别是在分子水平和细胞水平研究较少，不利于科研和药物评价。益气温阳活血方是一组针对心力衰竭病机的临床有效方剂，方中主要成分为人参、黄芪、丹参、益母草、白术、茯苓、桂枝等。本研究表明，益气温阳活血方能降低肥大心肌细胞蛋白质合成速率、MMP-2、MMP-9以及NE含量，同时升高TIMP-1、TIMP-2含量，抑制β3-AR和蛋白质的表达。由此推测，益气温阳活血方抑制心肌肥大的机制，可能是通过抑制交感神经兴奋，减少NE分泌，阻断心力衰竭时过分激活的β3-AR，降低心肌细胞蛋白质的合成速率以及MMP-2、MMP-9含量，升高TIMP-1、TIMP-2含量，逆转心肌肥大，具有与非选择性β 受体阻滞剂——卡维地洛相同的防治心肌肥大作用，值得临床进一步推广。

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