Notch2/Hes-1信号通路活化参与调控肾缺血-再灌注诱导炎症因子的表达研究*

黄仁发，赖虹伊，梁群卿，黄国东，向少伟，汪东涛，马晓露，黄海燕，胡维，林心如，周巧玲

（1.广西中医药大学附属瑞康医院 肾内科，广西 南宁530011；2.广西中医药大学，广西 南宁530023；3.广西中医药大学附属瑞康医院 健康管理中心，广西 南宁530011；4.中南大学湘雅医院 肾内科，湖南 长沙410008）

前期研究表明，肾缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）可诱导大鼠血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorsα，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）表达增多，肾小管上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）表达上调，证实肾IRI存在炎症过程，肾小管上皮细胞在肾IRI时可转化为炎症细胞[1]。但这种转化的信号机制是什么？本研究应用Notch信号关键酶γ-泌肽酶（γ-secretase）抑制剂DAPT阻断Notch信号通路活化后，观察Notch2/Hes-1信号通路活化是否参与调控肾缺血-再灌注（IR）诱导肾小管上皮细胞转化为炎症细胞的过程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取10～12周龄健康雄性清洁级SD（sprasue-dawley）大鼠，体重（210±34）g，共45只，购自上海斯莱克景达实验动物有限公司长沙分公司，动物合格证号：SCXK（湘）2009-0004，于湘雅医学院实验动物学部饲养。在室温18～25℃，相对湿度50%～60%，人工12 h昼/夜循环照明环境中，用全价营养，分笼饲养。每日定时清洗笼舍，大鼠自由摄食及饮水。

1.1.2 DAPT的配置方法 5 mg的DAPT加入DMSO 1ml溶解，配制溶度为10mol/L（5mg/ml）的储存液。实验前根据大鼠体重取适量储存液，每次灌胃前加入生理盐水，配制总体积为2ml的工作液。工作液使用前在超净工作台配制。

1.1.3 主要的仪器和试剂 BX-50生物光学显微镜和激光共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss），γ-secretase抑制剂DAPT（5mg，美国Sigma公司），蛋白提取试剂盒（上海申能博彩生物技术公司），BCA蛋白定量试剂盒（江苏碧云天生物技术公司，PMSF（江苏碧云天生物技术公司），PDVF膜（苏州广惠科技有限公司），大鼠TNF-α ELISA kit和大鼠IL-6 ELISA kit（美国BPB Biomedical公司），兔抗大鼠MCP-1（武汉博士德生物技术有限公司），兔抗大鼠Notch2多克隆抗体、兔抗大鼠Hes-1多克隆抗体和FITC标记的山羊抗兔IgG（美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立与分组 实验动物术前禁食12 h，自由进水，术前用10%水合氯醛溶液（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉。沿腹部正中线切口，逐层切开分离皮肤、肌肉、腹白线进入腹腔后，切除右侧肾脏（作为正常组大鼠肾组织），于结肠脾曲外侧切开后腹膜，暴露左侧肾脏，游离左输尿管和肾上腺避免损伤，再游离左肾蒂。稳定10min后将大鼠随机分成3组，每组15只，持续夹闭左肾动脉60min后恢复灌注。缺血-再灌注组（I/R组）恢复灌注后予以生理盐水[2ml/（d·只）]灌胃；γ-secretase抑制剂组（DAPT组）恢复灌注后予以γ-secretase抑制剂DAPT[500μg/（100 g/d）]灌胃；假手术组（Sham组）分离肾蒂但不夹闭左肾动脉，术后予以生理盐水[2ml/（d·只）]灌胃。3组在灌注后24、48和72 h各处死大鼠5只。

1.2.2 检测各组大鼠肾功能、血清TNF-α、IL-6水平 全自动生化仪检测大鼠肾功能，ELISA法检测各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

1.2.3 各组大鼠肾脏病理改变 取左侧肾脏置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液，将标本依次行固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡，HE染色，每张切片在高倍镜下取外髓质部10个视野，作半定量分析并计算均值[2]：无病变为0分；病变≤10%为1分；11%～25%为2分；26%～45%为3分；46%～75%为4分；病变>75%为5分。光学显微镜下（×20）观察各肾脏标本病理切片的形态改变，分析各组大鼠肾小管病理损伤程度。

1.2.4 激光共聚焦免疫荧光法检测各组大鼠肾组织Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白的表达 冷冻切片95%固定，PBS冲洗，1%Triton透膜，羊血清工作液封闭，分别滴加Notch2多克隆抗体（1∶150）、Hes-1多克隆抗体（1∶150）、MCP-1多克隆抗体（1∶150），4℃孵育过夜，然后分别滴加FITC标记（绿色荧光）的山羊抗兔IgG（二抗，1∶500），50%缓冲甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察并摄像。

1.2.5 W estern blot检 测 肾 组 织Notch2、H es-1、MCP-1蛋白的表达 取新鲜肾组织50～100mg提取总蛋白后，测蛋白浓度，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，Notch2多克隆抗体（1∶300）、Hes-1多克隆抗体（1∶300）、MCP-1多克隆抗体（1∶300）孵育过夜，辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG孵育（用含0.5%脱脂奶粉的TBET稀释1∶10 000），最后用化学发光得到胶片，蛋白条带用凝胶光密度分析软件测其OD值，用β-actin蛋白作为内参照，通过计算比值（OD目的蛋白/ODβ-actin蛋白），即目的蛋白的表达量来分析目的蛋白表达的相对水平，分析两组大鼠肾组织Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白的表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，如方差齐，组间比较用方差分析及LSD多重比较；如方差不齐，则用非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠尿素氮和血肌酐水平比较

生化结果显示，Sham组大鼠尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平无明显升高。而IR后大鼠肾功能明显受损，术后BUN、Scr水平升高，24h达到高峰，48和72h逐渐降低。与相同时间Sham组比较，24、48和72 h I/R组大鼠BUN、Scr水平升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。经DAPT处理后，与相同时间I/R组比较，大鼠24、48和72 h BUN、Scr水平显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表1、2。

表1 3组大鼠BUN水平比较 （n=5，mg/dl，±s）

表1 3组大鼠BUN水平比较 （n=5，mg/dl，±s）

注：1）与Sham组比较，P<0.01；2）与I/R组比较，P<0.01

组别 24 h 48 h 72 h Sham组 14.62±3.02 13.93±4.11 13.92±3.92 I/R组 50.44±6.621） 45.87±4.981） 31.77±6.001）t值 10.610 7.340 8.281 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT组 46.03±5.112） 38.49±7.392） 25.13±6.482）t值 4.473 4.652 4.335 P值 0.002 0.001 0.005

表2 3组大鼠Scr水平比较 （n=5，mg/dl，±s）

表2 3组大鼠Scr水平比较 （n=5，mg/dl，±s）

注：1）与Sham组比较，P<0.01；2）与I/R组比较，P<0.01

组别 24 h 48 h 72 h Sham组 0.41±0.08 0.40±0.09 0.42±0.08 I/R组 3.91±0.361） 3.26±0.361） 2.32±0.261）t值 11.330 7.126 6.985 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT组 3.33±0.282） 2.63±0.272） 1.70±0.322）t值 4.058 4.115 4.231 P值 0.005 0.003 0.002

2.2 大鼠肾脏病理改变

Sham组大鼠肾小球、肾小管间质均未见明显病变；I/R组大鼠肾小管病变以皮髓交界处最为明显，可见刷状缘丢失、基底膜裸露、小管扩张、管腔内管型形成、间质炎症细胞浸润及小管上皮细胞再生等病变。经DAPT处理后，肾小管结构较I/R组明显完整清晰，管腔内容物较I/R组减少，炎症细胞浸润较I/R组明显减轻。肾小管间质半定量评分显示，与相同时间Sham组比较，I/R组肾小管间质评分明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）。与相同时间I/R组比较，DAPT组大鼠肾小管间质评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1和表3。

2.3 大鼠血清肿瘤坏死因子-α 和白介素-6表达比较

结果显示，肾IR诱导血清IL-6和TNF-α 水平显著升高，再灌注后24 h达最高峰，之后逐渐下降，但72h仍高于Sham组，与相同时间Sham组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；经DAPT处理后，与相同时间I/R组比较，大鼠血清IL-6和TNF-α 水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见表4、5。

2.4 大鼠肾组织Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白表达比较

图1 3组大鼠肾脏病理改变 （HE染色×20）

表3 3组大鼠肾小管间质半定量评分比较 （n=5，±s）

表3 3组大鼠肾小管间质半定量评分比较 （n=5，±s）

注：1）与Sham组比较，P<0.01；2）与I/R组比较，P<0.01

组别 24 h 48 h 72 h Sham组 0.38±0.16 0.36±0.24 0.32±0.13 I/R组 3.52±0.221） 2.70±0.231） 2.32±0.311）t值 12.053 8.659 7.085 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT组 2.78±0.332） 1.90±0.212） 1.06±0.402）t值 4.121 4.132 5.231 P值 0.002 0.002 0.001

表4 3组大鼠血清IL-6水平比较 （n=5，pg/L，±s）

表4 3组大鼠血清IL-6水平比较 （n=5，pg/L，±s）

注：1）与Sham组比较，P<0.01；2）与I/R组比较，P<0.01

组别 24 h 48 h 72 h Sham组 782.23±99.19 739.84±152.42 754.65±107.71 I/R组 3 749.26±588.921） 3 000.87±381.761） 1 286.43±215.381）t值 15.067 13.613 8.257 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT组 2 179.62±391.942） 1 735.47±422.352） 849.45±157.132）t值 8.144 7.562 4.835 P值 0.000 0.000 0.002

表5 3组大鼠血清TNF-α 水平比较 （n=5，pg/L，±s）

表5 3组大鼠血清TNF-α 水平比较 （n=5，pg/L，±s）

注：1）与Sham组比较，P<0.01；2）与I/R组比较，P<0.01

组别 24 h 48 h 72 h Sham组 112.92±47.95 108.21±36.63 113.56±39.58 I/R组 2 071.08±391.811） 1 758.44±158.051） 647.26±164.571）t值 12.053 8.659 7.085 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT组 1 557.81±237.252） 1 155.25±262.832） 173.97±111.132）t值 4.121 4.132 5.231 P值 0.002 0.002 0.001

免疫激光共聚焦结果表明，Sham组大鼠肾小管未见Notch2阳性蛋白表达，可见少量的Hes-1和MCP-1阳性蛋白表达，肾IR后24 h可见肾小管大量的Notch2、Hes-1和MCP-1阳性蛋白表达，尤其以受损的远端肾小管荧光最强，48 h后荧光变弱，72 h仍可见阳性蛋白表达。DAPT处理24 h后，Notch2、Hes-1和MCP-1蛋白荧光均变弱，72 h仍可见少量的荧光。Western blot结果与免疫组织化学结果相似，但经DAPT处理72 h后，未见Notch2和Hes-1蛋白凝胶条带。与相同时间Sham组大鼠比较，I/R组大鼠24、48和72h的Notch2、Hes-1和MCP-1蛋白表达上调，差异有统计学意义（P<0.01）。与相同时间I/R组比较，DAPT组大鼠肾组织24、48和72 h的Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白和Caspase-1 2蛋白表达下调，差异有统计学意义（P<0.01）。见图2～7和表6。

图2 两组大鼠肾组织Notch2蛋白的表达 （免疫激光共聚焦法×400）

图3 两组大鼠肾组织Hes-1蛋白的表达 （免疫激光共聚焦法×400）

图4 两组大鼠肾组织MCP-1蛋白的表达 （免疫激光共聚焦法×400）

图5 3组大鼠肾组织Notch2、Hes-1和MCP-1蛋白表达（Western blot）

图6 3组大鼠肾组织中Hes-1蛋白的表达

图7 3组大鼠肾组织MCP-1蛋白的表达

表6 两组大鼠肾组织中Notch2蛋白表达的比较（n=5，±s）

表6 两组大鼠肾组织中Notch2蛋白表达的比较（n=5，±s）

注：†与DAPT组比较，P<0.01

组别 24 h 48 h I/R组 0.59±0.06 0.49±0.06 DAPT组 0.42±0.06† 0.40±0.05†t值 4.786 4.679 P值 0.002 0.002

3 讨论

Notch信号是一进化上高度保守的细胞间信号传导通路，作用广泛，可精确调节细胞的增生、分化、迁移、生长和死亡的过程，对个体的发育，尤其是三维结构器官的发育起决定性作用。其由一系列的蛋白分子家族组成，包括Notch受体、Notch配体、正负修饰分子以及转录因子[3-4]。Notch信号具有高度保守性，人和老鼠有4个Notch受体，即Notch1～4；Notch的配体在果蝇为Delta、Serrate，线虫为Lag-2。因此Notch的配体又被称为DSL蛋白[5]。Notch信号通路活化的关键是早老素依赖的γ-secretase（S3）裂开Notch受体的胞内段（notch intracellular domain，NICD），并释放NICD转位至细胞核，在细胞核与CSL蛋白相结合[5]。因此，笔者通过γ-secretase抑制剂DAPT阻断Notch信号后，观察下游转录分子的改变。

最近研究表明，Notch信号通路参与肿瘤的侵袭、转移[6]，心肌细胞IRI[7]，以及肝纤维化过程[8]，而且通过影响核转录因子κB转录，调控TNF-α、IL-6、MCP-1等炎症因子表达增多，参与类风湿关节炎滑膜炎症的形成过程[9]。前期研究表明，肾IRI存在炎症过程，肾小管上皮细胞可以转化为炎症细胞[1]。有研究表明，肾IRI可以诱发Notch2/Hes-1信号通路重新活化，参与肾小管的再生过程[10]。那么，Notch2/Hes-1信号通路是否参与肾IRI诱发的炎症过程？

本研究结果显示，肾I/R后，肾小管可见刷状缘丢失、小管扩张、管腔内管型、间质炎症细胞浸润等肾小管坏死改变，肾小管间质半定量评分明显高于Sham组，提示模型建立成功。而经DAPT处理后，肾小管病理改善，半定量评分降低，表明DAPT可能具有良好的肾保护作用。

进一步研究发现，正常的肾组织无Notch2蛋白表达，仅见少量的Hes-1蛋白表达，与既往的文献报道一致[11]。然而IR诱导肾组织Notch2和Hes-1蛋白表达显著增多，提示肾IRI时肾小管上皮细胞Notch2/Hes-1信号通路被重新激活。本研究结果还发现，Notch2和Hes-1蛋白表达的高峰时间与TNF-α、IL-6和MCP-1表达一致，于再灌注后24 h达高峰，提示Notch2/Hes-1信号通路的活化可能参与肾IRI时肾小管上皮细胞TNF-α、IL-6和MCP-1的转录。笔者进一步研究发现，DAPT选择性地阻断Notch信号活化后，TNF-α、IL-6和MCP-1表达显著下调，表明活化的Notch2/Hes-1信号通路可能参与调控TNF-α、IL-6和MCP-1的转录。

目前，国内外尚未见Notch信号通路活化是否参与肾IRI相关炎症的报道，但较多研究表明，Notch信号通路的活化参与多种炎症病理过程，如KANG等[12]研究证实，Notch信号通路参与过敏性哮喘的炎症病理过程，γ-secretase抑制剂可通过调节Th1和Th2细胞的反应，抑制NF-κB信号活化，从而减轻过敏性哮喘的炎症反应。NAKAZAWA等[13-14]研究表明，类风湿关节炎滑膜细胞的Notch1信号表达增多，γ-secretase酶抑制剂可以抑制TNF-α 诱导的类风湿关节炎滑膜细胞增生，提示Notch信号通路可能参与类风湿关节炎的炎症过程。FERNANDEZ等[15]研究发现，在TNF-α 刺激下，骨髓的微环境表达Notch受体及配体增多。因此，笔者推测Notch信号通路的活化可能参与肾IRI相关的炎症过程。DAPT处理可降低血清BUN、Scr水平，改善肾小管间质损伤，提示DAPT具有良好的肾保护作用。进一步研究发现，DAPT可下调Notch2、Hes-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的表达，提示DAPT的肾保护作用可能与一定程度地阻断Notch2/Hes-1信号通路活化后，继而抑制TNF-α、IL-6和MCP-1的转录，发挥抗炎作用有关。本研究从体内外证实Notch信号通路有望作为急性肾损伤治疗的新靶点。

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