云南汉族人群CTLA-4基因多态性与自身免疫性甲状腺疾病的关系*

王毅鹏 彭葆坤 朱丽芹 翁晓春 王瑛 唐哲

自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD），包括弥漫性毒性甲状腺肿（Graves disease，GD）和桥本氏甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT），是器官特异性自身免疫性疾病。其发病为多基因遗传与复杂的环境因素共同作用的结果[1]。近年来有多项研究显示细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 （Cytotoxic T lymphocyteassociated Antigen 4，CTLA-4）在GD遗传易感性中占有重要的地位[2-5]。CTLA-4又名CD152分子，是一种T细胞上的跨膜受体，在T细胞表面重要的协同刺激分子受体。免疫反应中T细胞活化有两类信号是必需的，第一类是抗原肽-HLA复合物，由抗原呈递细胞所呈递和特殊的T细胞受体识别，然后将信号传递给T细胞。第二类就是协同刺激信号，由抗原呈递细胞上的协调刺激分子与T细胞表面相应的受体结合而产生。如果缺乏此类信号，T细胞会出现活化障碍，处于无反应状态甚至被诱导凋亡；反之若此类刺激过度则可能激活自身反应性T细胞，导致自身免疫疾病的发生。B7：CD28/CTLA-4为此过程中最重要的协同刺激途径。CTLA-4与CD28共同享有B7分子配体，其中CD28识别B7-1和B7-2后为T细胞提供正性的共刺激信号，而CTLA-4与B7结合后则对T细胞活化起负调节作用[6]。

关于CTLA-4基因多态性与AITD的相关性，国内外各家报道不尽相同，为此，笔者对GD、HT患者的CTLA-4基因第1外显子第17密码子49位点A/G多态性进行研究，以深入探讨关于CTLA-4与AITD的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院内分泌科就诊并确诊的GD及HT患者，其中有82例GD患者为GD组，男24例，女58例，平均年龄（28.4±7.0）岁；51例HT患者为HT组，男11例，女40例，平均年龄（28.7±4.3）岁。根据临床表现、体格检查、辅助检查（甲状腺功能测定和甲状腺超声）诊断。选取健康对照组80例，男30例，女50例，平均年龄（30.5±8.1）岁，均来自本院体检中心，均无甲状腺疾病及其他自身免疫病的家族史。三组在年龄、性别、饮酒和吸烟等方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有研究对象均为云南地区的汉族。

1.2 CTLA-4基因多态性测定

1.2.1 标本采集 使用乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）抗凝管，取受检者空腹（禁食12 h后）静脉血2 mL，-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 DNA的提取 用AxyPrep血基因组DNA试剂盒从收集的血标本中提取基因组DNA，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 目的片段聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）由 上 海 生 物 工 程 有 限公司合成引物，引物序列为：上游引物：5'-GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3'， 下 游 引 物：5'-AGTCTCACTCACCTTTGCAG_3'，扩增片段长度为162 bp。PCR反应体系：将保存的基因组DNA原液用DNA溶解液稀释至5~10 ng/L。PCR反应体系为15 μL，10×Taq buffer扩增缓冲液1.5 μL；4种dNTP混合物0.3 μL（2.5 mM each）；上下游引物各 0.2 μL；模板 DNA 0.5 μL；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL；MgCl2为1.2 μL；加双蒸水11 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min， 然后按照 95 ℃变性 30 s， 67.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸 60 s，循环 20次；95 ℃变性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环20次；最后72 ℃延伸 6 min。

1.2.4 限制性内切酶法检测CTLA-4基因多态性 将PCR扩增产物用限制性内切酶Bbv1在37 ℃恒温箱中消化24 h，之后用3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段，若出现162 bp一条条带，判定为AA纯合基因型；若出现162、88 bp和74 bp三条条带，判定为AG杂合基因型；若出现88、74 bp两条条带，判定为GG纯合基因型。

1.3 统计学处理 经Hardy-Weinberg遗传平衡检验检验各组基因频率、等位基因的分布；数据的统计学分析使用SPSS 21.0统计学软件进行，计量资料符合正态分布，以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料的比较采用 X2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTLA-4基因第1外显子第17密码子49位点基因型及等位基因分布频率比较 经Hardy-Weinberg平衡法检验各组基因频率表明，实际值与根据Hardy-Weinberg定律计算而得的理论值间差异无统计学意义（ X2=0.13，P=0.72； X2=1.68，P=0.19； X2=2.11，P=0.15）。此3种基因型频率均符合Hardy-Weinberg定律，等位基因的分布具群体代表性。

2.2 各组基因型及基因型分布频率 GD组GG基因型的频率及等位基因G的频率明显高于健康对照组（ X2=9.353，P=0.009； X2=7.548，P=0.006），见表 1。而HT组GG基因型的频率及等位基因G的频率与对照组比较差异无统计学意义（ X2=0.062，P=0.969； X2=0.046，P=0.830），见表 2。

表1 GD组和对照组基因型及等位基因分布频率 频次（%）

表2 HT组和对照组基因型及等位基因分布频率 频次（%）

3 讨论

CTLA-4基因定位于2q31-33，包括有4个外显子和3个内含子。CTLA-4基因第1外显子第17密码子49位点为目前公认的CTLA-4与GD相关的多态性位点之一，其余还有位于第一内含子+1822位C/T等位基因等[7-8]，位于启动子-318位点T/C等位基因和位于第四外显子3'非翻译区的+642位（AT）n可变重复序列等[9-11]。

国内外关于CTLA-4基因CTLA-4基因第1外显子第17密码子49位点多态性与AITD的相关性的研究结论不尽相同，有研究发现两者密切相关[2-3，12-13]，而Pastuszak等[14]研究则发现两者并无相关性。王栾等[15]研究发现GD患者和HT患者CTLA-4基因第1外显子的第17密码子49位点G等位基因频率均高于对照组。并且GD组和HT组按性别分层分析后发现该等位基因分布无性别差异。余绮玲等[16]对广东地区汉族人群100例GD患者与100名健康人的CTLA-4基因G49基因多态性进行检测，发现GD组GG基因型和G等位基因频率较正常对照组显著增高。解剖学研究，然而姚斌等[17]对广东地区汉族人120例GD患者及123名正常人CTLA-4基因进行研究后得出了相反的结论，其A49G位点的基因型、等位基因频率也没有表现出差异。

康毓芝等[18]研究发现宁夏地区GD患者组与对照组之间CTLA-4基因SNP （49）A/G的基因型分布具有统计学差异，GD组患者GG基因型和G等位基因频率明显升高。王淑琼等[19]研究发现GD患者的CTLA-4第1外显子的A/G49位点GG基因型频率及G等位基因频率较正常对照组显著增高提示CTLA-4基因可能是汉族人群中GD的易感候选基因。朱凌燕等[20]对江西地区汉族人群99例GD患者和107例健康对照者CTLA-4基因第1外显子第49位点的基因型进行检测。结果发现GD患者GG纯合子为46.47%，对照组GG纯合子GG纯合子为21.50%，两者之间有明显的统计学差异。

不同地区和种族的结果可能是抽样误差造成的，也可能是种族差异造成的。本研究检测了82例GD患者，51例HT患者和80例健康人外周血CTLA-4基因第1外显子的第17密码子49位点的基因型并行分析，结果显示GD组GG基因型的频率及等位基因G的频率明显高于健康对照组（ X2=9.353，P=0.009； X2=7.548，P=0.006），而HT组GG基因型的频率及等位基因G的频率与对照组比较差异无统计学意义（ X2=0.062，P=0.969； X2=0.046，P=0.830）。提示携带 CTLA-4基因第1外显子第17密码子49位点GG基因型的个体发生GD的风险明显增加。本研究与国内多数学者的研究结果相一致。

探讨CTLA-4基因多态性与GD发病风险增加相关的原因可能在于CTLA-4第1外显子第17密码子49位点的不同基因型影响到了CTLA-4蛋白的表达及功能，从而导致不同的个体自身免疫性疾病的易患性的差异。进一步查证该基因序列发现，CTLA-4第1外显子第17密码子49位点单核苷酸基因多态性可导致该位点蛋白质翻译时出现苏氨酸和丙氨酸的置换，而这种置换可能会出现CTLA-4蛋白表达减低和糖基化的效率降低的结果[12]，而且有研究发现该位点G等位基因的多态性可使甲状腺抗体，甲状腺球蛋白及甲状腺过氧化物酶抗体滴度升高[13，21]。同时，它与其他多态性位点连锁不平衡还可影响其mRNA的稳定性。也有研究显示G等位基因能减少CTLA4的表达，增加自身反应性T细胞增殖，而AA基因型与GG基因型相比，刺激后在mRNA水平和蛋白水平都有更高的CTLA4 表达[2-3]。

本研究显示，提示CTLA-4在此过程中起了重要的作用，然而要阐释清楚CTLA-4在GD致病机制中究竟扮演何种角色，需要进一步对其基因连锁、免疫、蛋白表达等方面进行更为深入的研究。

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