双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用*

沈珂 吴群英 蒋晓山

细胞内蛋白质通常需要与其他蛋白质或配体结合，形成瞬时或稳定的复合体来实现其特定的功能，这种蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人类、酵母、植物、线虫等各种生物体的生命活动中起着十分重要的作用[1-4]。目前，PPI研究技术发展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等离子共振（SPR）、蛋白质芯片等体外实验技术，以及酵母双杂交、蛋白质片段互补（PCA）、荧光共振能量转移（FRET） 技术等。近十余年兴起的双分子荧光互补 （bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术由于无需试剂检测，能够通过荧光显微镜在接近活细胞生理状态的条件下快速、直观地检测目标蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的应用正日益广泛。

1 BiFC技术的原理

Regan（2000）和Kerppola（2002）两个研究小组最早发现和验证了活细胞内 BiFC 现象。他们首先将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，然后将一组相互作用、同向平行的亮氨酸拉链（bFos和bJun）分别融合到从Ala154-Asp155之间切开的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，导入大肠杆菌中共表达。结果发现，所构建的一对融合多肽能够在细菌细胞中产生YFP的荧光，他们将这个现象称之为BiFC[5-6]。

除EYFP外，目前BiFC技术涉及的荧光蛋白已扩展到绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）及其突变体等多种荧光蛋白，其原理都是将荧光蛋白在特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端 2个多肽，称为 N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发组装成完整的荧光蛋白。但是，当这2个荧光片段分别融合到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两组融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个互补片段在空间上互相靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，受到激发后发射出特定波长荧光（图1）。

图1 BiFC原理示意图注：NGFP，GFP-N 端；CGFP，GFP-C端；A与B，能发生相互作用的一对蛋白

2 BiFC荧光蛋白的发展

早期用于BiFC 实验的荧光蛋白主要为绿色荧光蛋白（GFP）及其突变体，包括 EYFP、EGFP、EBFP和ECFP[7-12]。由于它们必须在低温下（30 ℃）预孵化0~24 h以促进互补片段组装形成成熟的色团分子，因此，不利于生理条件下的胞内蛋白质相互作用的研究。2004-2008年，可应用于生理条件下的黄色荧光蛋白Citrine和Venus以及青色荧光蛋白Cerulean荧光蛋白被相继引入BiFC技术[13]。2006年，Lin等[14]利用红色荧光蛋白 DsRed和eqFP578发展而来的mPlum，mKate，mKate2和Katushka荧光蛋白，构建了一组远红光荧光蛋白（far-red fluorescent proteins，FRFP）BiFC 系统。由于远红光能量低、穿透力强、不易引起细胞自发荧光和不易被细胞吸收，因此，能够克服在哺乳动物中无法实现荧光蛋白在组织成像的问题，在哺乳动物的组织成像中具有巨大的应用前景。2010年，梳状珊瑚中发现了类似于GFP的绿色荧光蛋白Dronpa[15]。Dronpa犹如一个光开关，在490 nm照射下发射出绿色荧光，而405 nm的波长照射则会使其猝灭。目前，以Dronpa为基础BiFC系统已用于揭示细胞核与细胞质间转录蛋白的作用机制、转录蛋白功能和蛋白质二聚化等的研究[16-18]。

3 BiFC技术在PPI研究中的应用

BiFC涉及的荧光蛋白不仅容易检测到BiFC信号，还可通过对可视化的荧光进行定量从而确定蛋白质相互作用的强弱。荧光蛋白片段一旦重建成完整荧光蛋白后大多数不可逆，因而特别适用于检测亚细胞环境中微弱的（mM级别） 和瞬时的相互作用[16]。2003年，Hu等[17]将 GFP，YFP，CFP，BFP分别在 155位或173位氨基酸处切开产生的N端片段和C端片段任意配对，进行荧光互补检测，首次将BiFC技术观应用于活细胞中PPI研究。

2014年，任页玫等[18]为了解S-periaxin蛋白在施旺氏细胞内分子状态，利用基于红色荧光蛋白mCherry的BiFC系统构建原核双分子荧光互补分析载体 pS-periaxin-Cherry（1-159）和 pmCherry（160-237）-S-periaxin，真核双分子荧光互补分析载体 pmyc-S-periaxin-MN1-159和 pMC160-237-S-periaxin ， 转化到E.coli BL21，结果发现，在真核及原核系统均观察到在 S-periaxin 蛋白介导下将mCherry 荧光蛋白的两个片段重新组装形成荧光复合物，发出红色荧光，证明S-periaxin蛋白存在同源蛋白相互作用。郭晓令等[19]为了验证PAC1同源二聚化现象，采用基于EYFP黄色荧光蛋白的BiFC系统，用带有EYFP N端基因标记的PAC1与带有EYFP C端基因标记的PAC1共转染 CHO细胞，发现完整的EYFP荧光信号，表明PAC1可发生同源二聚化。

细胞内存在着多种信号转导通路，借助BiFC技术，对信号级联反应中蛋白质的相互作用进行观察与分析，可以进一步阐明信号通路的传递机制及生理功能提供了有力的支持[20-22]。K-Ras蛋白是很多信号转导通路中的分子开关，参与多种细胞生物学过程的信号传导及其调控，在细胞生长、增殖、分化和癌变过程中扮演着重要角色。一般认为在信号传递过程中，位于细胞膜上的Ras蛋白将Raf1从胞浆招募到胞膜。2012年，Li等[23]通过BiFC实验证实，Raf1和K-Ras在细胞内的定位分别在胞浆和胞膜，当Raf1从胞浆转运到细胞膜并与膜上的K-Ras结合形成复合物时，细胞内MAPK/ERK信号转导的级联反应才会启动；该研究还认为K-Ras/Raf1复合物的膜定位并不完全依赖K-Ras，K-RAS/Raf1的形成起着在这一过程中起关键作用，揭示了Raf1从胞浆到胞膜转运的机制。

2014年，Yu等[24]运用BiFC证实PAC1为一种具有内在二聚体活性的配体非依赖性细胞表面受体，且其二聚化与Wnt/β-catenin信号通路相关，揭示了PAC1二聚体依赖的基础活性，有助于理解PAC1的生理和病理作用，促进了PAC1靶向药物的发展。

4 多色荧光 BiFC 技术

多色荧光互补技术（multicolor fluorescence complementation，MFC）弥补了BiFC 技术只能检测两两蛋白质之间的相互作用的不足。Hu等在双分子荧光复合物之间的光谱差异的基础上，将bJun，bFos bATF2共 表 达 等 量 的bJunCC155和bFosCN173，bATF2YN173，所产生的青色荧光与共表达bJunCC155和bFosCN173相当，而黄色荧光却只有共表达bJunCC155和bATF2YN173的不到1%。换 用 bJunCC155，bFosCN155，bATF2YN1553实 验，得到相同结果。再次共转bJunCC155，bFosCN155，bATF2YN1553入细胞，并过表达 bJunCC155，就能同时检测到青色荧光和黄色荧光。表明bFos，bATF2都能与bJun发生相互作用，并且bFos的结合能力远强于 bATF2，在bFos和bATF2同时存在时，bJun优先与bFos结合[17]。

5 BiFC-FRET技术检测多种蛋白质间的相互作用

传统的BiFC技术限于两个分子之间的相互作用，有一定的局限性，因为很多信号蛋白是以寡聚体形式发挥作用。为了克服这个难题，2008年，Shyu等[25]将BiFC技术和FRET技术结合起来，建立了基于双分子荧光互补的荧光共振能量转移技术（BiFC-FRET），该技术采用青色荧光蛋白Cerulean 和1个基于黄色荧光蛋白Venus的BiFC系统联用，能同时检测3个蛋白之间的相互作用。其做法是将 bJun和bFos分别和Venus荧光蛋白的N端C端片段相连，Cerulean 蛋白与NFAT1蛋白相连，bJun和bFos 的相互作用使得Venus蛋白重建；当和 Cerulean 融合的蛋白NFAT1和bJun和bFos异源二聚体相互作用时，Cerulean 可以作为供体将能量共振转移至重建后的 Venus 荧光蛋白，实现3个蛋白质相互作用的共检测。由于荧光互补技术依赖于荧光蛋白的自身性质，并非所有荧光蛋白都能用于该项技术，因此蛋白选取和荧光性质检测是该技术的关键[26]。

6 BiFC 在流式细胞术定量分析中的应用

Morell等[27]（2007年）采用流式细胞术对BiFC荧光蛋白复合物的荧光信号进行检测，创建了一种实时检测细胞内PPI的研究方法，即双分子荧光互补流式分析技术（bimolecular fluorescent complementationflow cytometry， BiFC-FC）。由于流式细胞仪（FACS）能够对荧光信号的阳性细胞数和平均荧光强度进行定量分析，且能检测到较弱的荧光信号，因此其检测结果较传统的荧光显微镜观察方法更为可靠。最近报道了一种由DsRed-Experss2突变而来 E2-Crimson，激发波长为611 nm，发射波峰为646 nm，对细胞无毒性，能够用于超高分辨率受激发射减损（stimulated emission depletion，STED）显微镜观察，在流式细胞检测中具有很好的应用前景[28]。Parvatiyar等利用BiFC-FC完成了HCV蛋白结构域与干扰素诱导基因之间相互作用的筛选，建立了病毒蛋白与宿主因子相互作用的高通量筛选方法[29]。目前，应用流式细胞技术对单个细胞内的BiFC信号进行定量分析，正成为活细胞BiFC实验的标准手段。

7 BiFC的缺点及改进

BiFC系统中重新形成完整活性蛋白的2个互补荧光蛋白片段，往往需要几分钟到几小时的自体催化才能完成，因此观察到的荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不适用于实时监测 PPI 及对蛋白复合体进行动力学分析[30-31]。另外，两个不发光的BiFC荧光片段往往会自发融合成互补蛋白，导致背景荧光的产生并且降低信噪比（S/N）比。Liu等[32]采用一个新的 BEVL-BiFC系统——将mLumin 1-151（Ln）和mLumin 151-233（Lc）两个荧光片段在双表达载体中构建BiFC 体系，结果表明该系统可以明显降低BiFC体系中因非特异性结合而导致的假阳性。Nakagawa等发现，特定位点缺失和定点突变可有效减少BiFC的假阳性结果[33]。最近报道，哺乳动物细胞中以Venus荧光蛋白（共238个氨基酸）为基础的BiFC试验中，对片段VN155（N碱基1-154黄色），VC155（碱基1-154蓝绿色）第7和第10号β折叠上的碱基进行定点突变，当V150L、I152L、L201V、和L207V这几个位点被替换掉后，将结合亮氨酸拉链实验构成的互补片段bJun-VN/bFos-VC转染到COS-1细胞后，发现自发荧光明显减少，信噪比明显改善[34]，值得注意的是V152L突变体在以Cerulean为荧光蛋白的BiFC实验中对信噪比的影响不大[35]，这提示笔者根据不同的BiFC系统应选择不同的突变体。在阴性对照选取困难的情况，采用竞争性BiFC技术不失为一种有效手段。如在同向平行的亮氨酸拉链bJun-YN155和bFos-YC155融合蛋白实验中[6]，当加入大量的单一亮氨酸肽链bJun或bFos后荧光互补现象被抑制，更进一步证明了bJun和bFos之间的结合反应。

8 展望

BiFC技术作为一种新近发展起来用于研究蛋白质间相互作用的方法，不仅能够直观地检测PPI、以及蛋白质基团之间相互作用的强弱关系，而且还可以检测受体之间自身交联反应，有助于阐明这些受体的功能和作用机制然而，BiFC技术本身仍存在局限性，如基于荧光蛋白的BiFC信号被认为是不可逆的[36]，虽然它的不可逆性有助于研究瞬时和较弱的蛋白相互作用现象，但也限制观测动态PPI。随着BiFC研究的深入和新的性能优异的互补片段的发现，BiFC技术必将在PPI研究中具有更加广泛的应用前景。

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