Hes-1和干扰素在丙型肝炎病毒感染中的检测意义

郭连峰，邱 雷，李 娜，杜红丽，张建东



·论著·

Hes-1和干扰素在丙型肝炎病毒感染中的检测意义

郭连峰，邱 雷，李 娜，杜红丽，张建东

目的 探讨Notch信号通路中的靶基因Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ三种干扰素与丙型肝炎病毒(HCV)感染的关系。方法 选取2012年11月—2014年10月在我院就诊的125例HCV感染患者，根据是否转归为肝硬化分为HCV感染组和HCV肝硬化组，同期选取100例健康人为对照组。采集HCV肝硬化组、HCV感染组和对照组晨起空腹静脉血3 ml，分离出单个核细胞，提取RNA，将其反转录为cDNA，应用实时定量RT-PCR技术检测Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ。结果 3组Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ水平之间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Notch信号通路中的靶基因Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ在HCV慢性感染时明显升高，且在HCV感染导致的肝硬化中，Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平更高。

丙型肝炎；Hes-1；干扰素类

丙型肝炎病毒(hepatitis c viros, HCV)感染是慢性肝炎的常见的病因之一。目前全球约有1.85亿HCV感染者，其中大约1.5亿是慢性感染。每年约有300万的HCV新增感染病例，其中70%～85%均发展为慢性肝炎，最终进展为肝硬化及肝细胞癌的不在少数。HCV感染非常隐匿，感染初期无任何症状，目前人们对HCV感染的危害性认识不足，所以延误治疗，错失最佳治愈的时机[1]。

Notch基因在20世纪初被发现，Notch信号通路通过细胞之间相互接触的旁分泌，直接将其转化为基因表达的改变[2]。Notch信号分子及其目的基因在细胞增殖、分化、凋亡过程中起着重要的作用，Hes-1是Notch信号通路下游、影响细胞增殖及分化的靶基因。研究表明，Notch信号通路对于炎症的发生与进展有很大关系[3]。干扰素(IFN)是1957年被发现的。它是一种分泌性蛋白，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，根据产生干扰素的细胞来源不同，IFN可以分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ3种[4]。有文献报道， IFN在病毒性肝炎中的表达水平会明显升高[5]。本文主要研究Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ与丙型肝炎进展的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象与分组 收集2012年11月—2014年10月在我院就诊的125例HCV感染者临床资料，其中男69例，女56例。年龄21～76岁，平均年龄41.9岁。分析HCV感染病例的病理及影像学资料，发现有32例已转归为肝硬化，将之归为HCV肝硬化组，其中男19例，女13例，年龄(62.3±13.5)岁，体重(59.3±17.1)kg。其余93例归为HCV感染组，其中男42例，女49例，年龄(43.5±19.4)岁，体重(61.5±15.6)kg。同期收集100例健康人作为对照组，其中男59例，女41例，年龄(41.7±20.5)岁，体重(60.2±13.5)kg。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂：荧光定量PCR仪为上海宏石医疗科技有限公司生产。人淋巴细胞分离液为北京Solarbio公司生产。Total RNA提取试剂为宝生物工程有限公司生产。PCR反应体系为康为世纪公司生产。PCR引物为英潍捷基(上海)公司生产。

1.2.2 提取单个核细胞：采集3组晨起空腹静脉血3 ml。室温18～28℃在生物安全柜中操作以避免微生物的污染，将新鲜抗凝血2 ml与Hank's液1：1混匀，沿管壁缓慢地加在2 ml人淋巴细胞分离液的液面上，然后1500 r/min离心(半径15 cm的水平转子)15 min，此时离心管中由上到下细胞分为4层。小心地收集第2层环状乳白色的淋巴细胞或单核细胞层，将反复洗2次得到的细胞加入Trizol试剂0.6 ml/管并混匀，匀浆裂解液放在-80℃低温冰柜保存，以备集中提取RNA。

1.2.3 RNA提取：取出前面提取的匀浆裂解液，加入氯仿(1/5体积量)，盖紧离心管管盖，用手剧烈振荡15 s，室温静置5 min后12 000 r/min，4℃离心15 min；小心取出离心管，吸取上清液转移到另一个新的离心管中(不能吸出白色中间层)；加入1 ml异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10 min；最后12 000 r/min，4℃离心10 min后得到RNA沉淀。对沉淀进行清洗和溶解后-80℃低温保存。

1.2.4 RNA浓度的测定：取一定量的RNA提取物，用DEPC水稀释n倍，用DEPC水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260/OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μl)=OD260×稀释倍数×40，RNA纯度OD260/OD280比值1.8～2.1。

1.2.5 反转录步骤：将1 μl的Random 6，1 μl N9，3 μl已提取的RNA，7.5 μl的DEPC水，体积共为12.5 μl，混匀，置于干热恒温器上65℃，5 min。然后加入4 μl的5×Buffer，2 μl的Dntp,1 μl的Transcriptase和0.5 μl的Rnaseinhibitor，置于水浴箱42℃，1 h，最后置于干热恒温器上，70℃，10 min。

1.2.6 聚合酶链反应(PCR)扩增：严格按照操作说明书操作，PCR引物为英潍捷基(上海)公司生产，引物的名称与序列，见表1。

注： IFN-α为α干扰素；IFN-β为β干扰素；IFN-γ为γ干扰素

1.2.7 计算方法:①实验组CT值减去实验组内参CT值，得到ΔCT1。②对照组CT值减去对照组内参CT值，得到ΔCT2，计算出平均ΔCT2。③ΔCT1减去平均ΔCT2，得到ΔΔCT。④计算出2-ΔΔCT为最终数据，进行统计分析[6]。

2 结果

与对照组比较，HCV感染组和HCV肝硬化组Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达水平升高(P<0.05)，与HCV肝硬化组比较，HCV感染组Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 3组Hes-1、IFN-α、IFN-β和IFN-γ表达水平比较

注：IFN-α为α干扰素；IFN-β为β干扰素；IFN-γ为γ干扰素;与对照组比较,aP<0.05;与HCV肝硬化组比较,cP<0.05

3 讨论

HCV感染十分常见，由于HCV抗原结构的特殊性，目前还没有直接检测血清中HCV抗原的技术，但直接检测抗体又存在滞后性，所以要控制HCV的传播、提高丙型肝炎的治疗效果急需及时、稳定和准确的实验室诊断与支持[7]。另外目前预防HCV感染还没有有效疫苗，也没有有效的治愈方法。因此，控制HCV感染只能从传染源和传播途径入手，早期诊断和发现HCV感染者就是最为有效的手段[8]。

Notch信号通路是调节细胞增殖和分化的重要通路，研究表明，Notch信号通路对多种疾病的发生、发展都有重要的影响，HCV感染主要引起肝脏的炎症病变，Notch信号通路也参与其中[9]，Hes-1是Notch信号通路的靶基因，与多种疾病的进展均有重大的关系。国内外文献报道鲜有Hes-1与丙型肝炎的关系的报道，曾有文献报道Hes-1在急性乙型肝炎患者CD8+ T细胞中表达明显升高，这与本文在丙型肝炎中的检测结果一致[10]。本文研究了Hes-1与丙型肝炎的关系，人体存在丙肝病毒感染时，Hes-1水平随即升高，当病毒感染得不到有效遏制而出现肝硬化时Hes-1水平升高更加显著。干扰素是一组由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。张艳宁等曾报道，干扰素α在乙肝病毒相关肾炎患者血清中表达水平明显升高[11]。丙型肝炎是由丙肝病毒感染引起的肝脏炎症，研究干扰素与丙型肝炎的关系是十分有必要的。本研究发现丙肝患者体内的干扰素表达水平比健康人显著升高，这与文献报道相似。

通过本研究可以得知，HCV感染可以引起Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达水平明显升高，其中以Hes-1表达水平升高最为明显，这说明Hes-1作为Notch基因的靶基因，在丙型肝炎的发生和发展中，起到非常重要的作用。丙肝患者感染后很少出现特异性症状，很多人一直到发生肝硬化或肝细胞癌等相关症状时才检出HCV感染[12-14]。不仅如此，HCV在患者体内的自发清除率低，大部分会慢性化发展[15]。因此本研究相信Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ等因子在丙型肝炎的诊断、病情评估和治疗方面将会发挥较好的临床参考价值。

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Value of Hes-1 and Interferon in Detection of Hepatitis C Virus Infection

GUO Lian-fenga， QIU Leib， LI Nac， DU Hong-lia， ZHANG Jian-donga

(a. Department of Clinical Laboratory, b. Department of Pathology, c. Emergency Department, the People's Hospital of Hengshui, Hengshui, Hebei 053000, China)

Objective To investigate the relationships between Hes-1 target gene of Notch signaling pathways and interferon-α (IFN-α), IFN-β and IFN-γ and hepatitis C virus (HCV) infection. Methods A total of 125 HCV inpatients admitted during November 2012 and October 2014 were divided into hepatic cirrhosis group (HC group,n=32) and HCV infection group (HCV infection group,n=93), while 100 healthy people at the same period were selected as control group. Samples of 3 ml venous blood with empty stomach in the morning were obtained from HC group, HCV infection group and control group, and mononuclear cells were isolated, RNA was extracted, and then obtained the reverse transcription of cDNA was performed. The levels of Hes-1, IFN-α, IFN-β and IFN-γ were detected using real-time quantitative RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) method. Results The differences in levels of Hes-1, IFN-α, IFN-β and IFN-γ in the three groups were statistically significant (P<0.05). Conclusion Hes-1 target gene of Notch signaling pathways and Hes-1, IFN-α, IFN-β and IFN-γ levels are significantly increased in HCV patients with chronic infection, but the levels are even more increased in hepatic cirrhosis induced by HCV infection.

Hepatitis C； Hes-1; Interferons

河北省衡水市科技局项目(13020z)

053000 河北 衡水，衡水市人民医院检验科(郭连峰、杜红丽、张建东)，病理科(邱雷)，急诊科(李娜)

R512.63

A

2095-140X(2015)06-0028-03

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.007

2015-02-01 修回时间:2015-02-27)