N-乙酰半胱氨酸对模拟失重大鼠肺损伤的防护作用研究

李月越,王 萍,朱敏立,赵雅辉,王小辉,崔 彦



·论著·

N-乙酰半胱氨酸对模拟失重大鼠肺损伤的防护作用研究

李月越,王 萍,朱敏立,赵雅辉,王小辉,崔 彦

目的 观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对模拟失重状态下大鼠肺损伤的影响。方法 采用大鼠尾吊法建立模拟失重大鼠模型。清洁级Wistar大鼠24只，随机分为A组、B组和C组，每组各8只。从实验第1天开始B组每天给予N-乙酰半胱氨酸300 mg/kg药物灌胃，A组、C组予以等量无菌注射用水灌胃。第2天A、B两组进行持续尾吊建立模拟失重模型，C组大鼠于笼内自由活动，7天后将所有大鼠处死取材，测定血中性粒细胞表面CD11b/c、中性粒细胞活性氧浓度，白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。取右肺上叶组织，切片行HE染色，观察肺组织结构变化。结果 A组显微镜下肺泡大小不一致，肺泡间隔水肿增宽，血管扩张充血，间质内可见中性粒细胞、淋巴细胞浸润。B组肺组织亦出现上述改变，但程度较A组轻，C组未见明显上述改变。各组间CD11b/c、活性氧(ROS)、TNF-α、IL-10、IL-6比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论 N-乙酰半胱氨酸能够减轻模拟失重状态下大鼠炎性反应和肺组织破坏，其抗氧化应激作用可能对肺组织损伤有一定保护作用。

模拟失重；大鼠, Wistar； N-乙酰半胱氨酸；保护作用

随着载人航天事业的不断发展，失重状态对人体各系统影响的研究日趋深入。肺是易受重力影响的器官之一。失重时下肢血液涌入低阻力、高顺应性、高流量的肺循环，造成肺组织淤血，严重者可诱发急性肺损伤。本研究筛选出近年证实具有抗氧化应激作用的N-乙酰半胱氨酸(n-acetys cysteine, NAC)，通过对失重状态下的大鼠进行干预，观察其与对照组大鼠的肺组织病理及中性粒细胞CD11b/c、中性粒细胞活性氧(reactzve oxygen species, ROS)浓度及白介素-10(IL-10)、白介素-6(interlevkin-6, IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎性细胞因子的比较，研究N-乙酰半胱氨酸对失重状态下肺是否有保护作用，为航天医学研究及临床防治急性肺损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

1.1.1 主要试剂： Anti-Rat CD11b/c PE、Anti-Rat Granulocyte Marker FITC购自美国eBioscience公司，大鼠IL-10、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司，大鼠中性粒细胞分离液试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限公司，活性氧检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.1.2 实验动物： 健康清洁级雄性Wistar大鼠24只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，体重为(270±20)g。

1.2 方法

1.2.1 尾吊大鼠模型的建立：雄性Wistar大鼠24只，按照随机数字表法分为A组、B组和C组，每组各8只。实验第1天称重，B组每天给予NAC 300 mg/kg灌胃[1]，A组及C组每天给予注射用无菌用水1 ml等量灌胃。实验第2天按照文献[2-3]的方法对A、B两组大鼠建立尾吊大鼠模型：每个鼠笼内尾吊1只大鼠，使大鼠前肢踏于笼底，尾部悬于笼顶，后肢悬空完全解除负荷，身体纵轴与水平面约成30°。C组大鼠于鼠笼内自由活动。实验环境为室温(22℃)，昼夜周期均为12 h，实验过程中所有大鼠可以自由进食、饮水。第8天处死实验大鼠，并进行取材、病理检查。

1.2.2 IL-10、IL-6、TNF-α及全血标本的处理：实验第8天取材，行局部麻醉后经腹中动脉取血，每只小鼠采集血液分别置于生化管中，于取血后2 h内，3000 r/min离心10 min后，取上部血清，保存于-80℃冰箱中待检。用ELISA法检测血液中炎性细胞因子IL-10、IL-6及TNF-α，按说明书操作。

1.2.3 中性粒细胞CD11b/c流式细胞仪检测：参照大鼠中性粒细胞分离液说明书分离中性粒细胞，取大鼠新鲜抗凝血1 ml，与全血及组织稀释液1∶1混匀后小心加入到1 ml分离液的液面上，以2000 r/min(半径15 cm水平转子)离心30 min，此时离心管中由上至下细胞分为4层。第1层为血浆层，第2层为单核细胞层，第3层为富集一定中性粒细胞的分离液层，第4层为红细胞层(含有一定中性粒细胞)。收集第3层和第4层，放入盛有2 ml细胞洗涤液的试管中，充分混匀后，以2000 r/min离心30 min，弃去上清液，加入6～10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1～2 min，以2000 r/min离心5 min，弃去红色上清，加入适量PBS溶液，重悬沉淀，2000 r/min离心5 min，重复1次，分离率为80%以上。1 ml PBS溶液配成中性粒细胞悬液，取500 μl的中性粒细胞悬液，加入1 μl Anti-Rat Granulocyte Marker FITC，5 μl Anti-Rat CD11b/c PE充分混匀，室温避光20 min，于中性粒细胞段开窗，测定CD11b/c荧光强度(mean fluorescence intensity， MFI) 。同时对各标本作阴性对照，除以等量同IgG-FITC抗体代替CD11b/c-FIT C抗体,每个样本检测10 000个细胞。

1.2.4 中性粒细胞ROS的检测：采用双乙酰基二氯荧光素(DCFH-DA)作为细胞内活性氧检测探针。在活性氧存在时，DCFH被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质，其荧光在激发波长502 nm,发射波长530 nm附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。首先将DCFH-DA工作浓度调整为20 μmol/L备用。取剩余500 μl的中性粒细胞悬液室温2000 r/min离心，弃去上清液，加入1 ml配好的DCFH-DA避光37℃水浴40 min。室温2000 r/min离心，去上清液，用PBS洗涤2次后重悬，配成500 μl的细胞悬液，将流式细胞仪(美国BD公司)按激发波长502 nm,发射波长530 nm调好后，进行检测。

1.2.5 肺组织病理学检查：实验第8天取材，每组均取右肺上叶组织，4%多聚甲醛固定，切片行HE染色，光学显微镜观察。

2 结果

2.1 肺组织病理结构改变 A组病变最严重，显微镜下可见肺泡大小不一致，肺泡间隔水肿增宽，血管扩张充血，间质内可见中性粒细胞、淋巴细胞浸润。B组显微镜下可见肺泡大小稍不一致，肺泡间隔增宽，间质内少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，程度较A组明显减轻。C组显微镜下可见肺泡大小一致，肺泡间隔未见明显增厚，血管无扩张充血，间质内可见极少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，见图1。

A组 B组 C组

图1 光镜下3组大鼠肺组织病理学形态(HE×100)

A组建立尾吊大鼠模型，每天给予注射用无菌用水1 ml等容量灌胃；B组建立尾吊大鼠模型，给予N-乙酰半胱氨酸 300 mg/(kg·d)灌胃；C组于鼠笼内自由活动，每天给予注射用无菌用水1 ml等容量灌胃

2.2 血中性粒细胞CD11b/c、活性氧(ROS)检测结果 3组间中性粒细胞CD11b/c和ROS比较差异具有统计学意义(P<0.01)，两两比较显示，A组中性粒细胞CD11b/c和ROS高于B组(t=62.82，P<0.01；t=181.84，P<0.01)和C组(t=143.67，P<0.01；t=2279.87，P<0.01)，见表1。

表1 3组大鼠中性粒细胞CD11b/c、活性氧的比较

注：A组建立尾吊大鼠模型，每天给予注射用无菌用水1 ml等容量灌胃；B组建立尾吊大鼠模型，每天给予N-乙酰半胱氨酸 300 mg/(kg·d)灌胃；C组于鼠笼内自由活动，每天给予注射用无菌用水1 ml等容量灌胃

2.3 TNF-α、IL-10及IL-6检测结果 3组间TNF-α、IL-10和IL-6比较差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，A组血清TNF-α、IL-10、IL-6高于B组(t=273.47，P<0.01；t=39.89，P<0.01;t=6.36，P<0.05)和C组(t=226.43,P<0.01；t=492.12，P<0.01;t=137.41，P<0.01)，见表2。

3 讨论

人类长期在地球引力下生活，已经适应了重力对人体的作用。随着我国载人航天事业飞速发展，宇航员须在脱离地球重力环境下生存和完成各种任务。探索和明确失重状态下航天员机体各器官系统的变化也变得愈加紧迫和重要，其中肺组织是对重力改变较为敏感的器官之一，失重会造成肺损伤，在肺组织损伤过程中，会出现急性炎性反应，故一些炎性细胞因子也会随之发生一系列变化[4-6]。受宇航员数量、实验设备及条件等诸多因素限制，目前国内外大多采用动物模型来模拟失重或微重力状态，经典方法为大鼠尾吊模型，进行地面课题研究[7-8]。本课题组前期研究及国内外其他学者研究发现，模拟失重状态下机体原有内环境稳态被打破，导致免疫系统出现功能失调，机体易患多种感染性疾病，机体的炎性反应增强，从而导致肺损伤，在肺损伤过程中多数细胞因子发生变化，如TNF-α及IL-6等[6,9]。

表2 3组大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-6指标比较

注：IL-10为白介素-10，IL-6为白介素-6，TNF-α为肿瘤坏死因子-α；A组建立尾吊大鼠模型，每天给予注射用无菌用水1 ml等容量灌胃；B组建立尾吊大鼠模型，每天给予N-乙酰半胱氨酸300 mg/(kg·d)灌胃；C组于鼠笼内自由活动，每天给予注射用无菌用水1 ml等容量灌胃

NAC是细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的前体，具有多种药理作用，可增加机体抗氧化能力，清除自由基，减少ROS，抑制TNF-α等所致细胞核因子NF-κB的活性，阻断NF-κB信号转导途经，下调IL-8、IL-6的表达，抑制炎性反应，对多种类型的急性肺损伤均有较明显的保护作用[10-11]。研究发现，A组大鼠肺组织损伤明显，肺泡大小不一，间隔增宽增厚，间质内较多中性粒细胞、淋巴细胞浸润；而B组的肺组织损伤减轻，间质内中性粒细胞明显减少，提示NAC可有效减轻模拟失重状态下大鼠肺组织伤害。

正常情况下，CD11b主要储存在胞质颗粒中，在细胞膜表面低水平表达，受细菌脂多糖、IL-8等刺激后，在细胞膜表面大量表达，对宿主炎性反应早期非特异性免疫功能的发挥起关键作用，还可通过延迟炎性细胞凋亡、诱导炎性介质大量释放，故被认为是中性粒细胞激活的标志[12-13]。ROS是指分子氧单电子还原后生成的化学反应性质活泼的某些氧代谢产物及其衍生物，在感染性疾病和某些因素刺激下，使呼吸氧爆发过于激烈，从而释放大量ROS，造成正常组织的损害，它是机体的炎性指标之一，研究表明NAC可减少ROS生成及减轻肺损伤，能减少CD11b在中性粒细胞表面的表达并降低中性粒细胞内ROS浓度，从而减轻炎性反应和肺损伤[14-15]。

IL-6是至今发现的生物学活性最广泛的细胞因子，具有抗炎和促炎双相的多效性因子，可以调节免疫应答，促进B细胞的增殖和分化。IL-10是一种重要的具有免疫调节作用的细胞因子，主要是由单核-巨噬细胞和各种亚群的T细胞合成分泌的一种具有多功能的抑制性细胞因子，能够减少中性粒细胞在肺内的募集，降低呼吸膜的通透性，从而减轻肺部炎性反应，与炎症程度呈正相关。TNF-α是诱导细胞凋亡，加重损伤的重要因子。以上炎性细胞因子可通过趋化、活化淋巴细胞、中性粒细胞等，产生免疫病理损伤，并可直接作用于细胞、微血管等，造成组织损伤[16-18]。本研究结果表明，A组的IL-6、IL-10及TNF-α炎性因子水平均最高，而B组的炎性因子水平均下降，说明NAC有减轻失重环境变化导致肺的炎性反应，具有保护肺组织的作用，可能成为未来航天医疗保护可供筛选的药物之一。

综上所述，NAC抗氧化作用能够减轻模拟失重状态下大鼠的炎性反应，可有效保护肺组织，减轻由失重所致的肺损伤。本研究不仅为今后航天医疗保障提供了科学实验数据，且临床上有大量长期卧床患者，而长期卧床对患者生理和病理生理变化的负面影响与失重引起的反应机制相似，故对该类患者呼吸系统疾病及肺损伤的防治可能亦有重要意义。

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Protective Effect of N-acetylcysteine on Pulmonary Injury under Simulated Weightless Condition in Rats

LI Yue-yuea, WANG Pinga, ZHU Min-lia, ZHAO Ya-huia, WANG Xiao-huia, CUI Yanb

(a. Department of Critical Care and Respiratory Diseases, b. Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To observe the effect of N-acetylcysteine (NAC) on pulmonary injury under simulated weightlessness in rats. Methods Tail-suspension method was used to establish the models of weightless simulation in rats. A total of 24 clean Wistar rats were randomly divided into group A, B and C (n=8 for each group). Group B was treated with NAC (300 mg/kg) by intragastric administration every day from the first day, while group A and C were treated with same volume of sterile water via intragastric injection. The models of weightless simulation were established in group A and B by tail-suspension method after the rats had been administrated for 2 d, while the rats in group C were free-running in the cage. The rats were killed at the end of the 7thd. The levels of superficial CD11b/c of neutrophilic granulocyte, reactive oxygen species (ROS) concentration of neutrophilic granulocyte, contents of IL (interleukin)-10, IL-6 and TNF (tumor necrosis factor)-α in the blood samples were detected. The superior lobe tissues of right lung were given hematoxylin and eosin stain (HE stain), and the pathological changes of lung tissues in slices were observed. Results In group A, under microscope, the sizes of alveoli were discrepant, the alveolar septum became wide with edema, and blood vessels were dilated and congested, and neutrophils and infiltrated lymphocytes were found in the interstitial. Similar changes of group A were found in group B, but the degrees were less than those in group A, while there were no obviously similar changes in group C. There were statistically significant differences in CD11b/c, ROS concentration, TNF-α, IL-10 and IL-6 (P<0.05,P<0.01). Conclusion NAC can alleviate inflammation and lung damages of rats under simulated weightlessness, and the antioxidation effect of NAC may play a role in protection of lung injury under weightless condition.

Weightlessness simulation； Rats, Wistar； N-acetylcysteine； Protective effect

全军医学科研“十二五”重点项目(BWS11J051)

100101 北京，解放军306医院呼吸与重症医学科(李月越、王萍、朱敏立、赵雅辉、王小辉)，普通外科(崔彦)

王萍，E-mail：pingwang306hpbj@163.com

R856

A

2095-140X(2015)06-0010-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.003

2015-02-07 修回时间：2015-03-01)