RCCS模拟微重力对铜绿假单胞菌毒力编码基因和蛋白质谱的影响

黄玉玲,徐冰心,张 军,段育忠,杨建武,周金莲,董满库,李成林,崔 彦



失重环境感染性疾病与机体损伤的研究

·论著·

RCCS模拟微重力对铜绿假单胞菌毒力编码基因和蛋白质谱的影响

黄玉玲,徐冰心,张 军,段育忠,杨建武,周金莲,董满库,李成林,崔 彦

目的 探讨三维细胞培养系统(RCCS)模拟微重力环境对铜绿假单胞菌(PA)毒力编码基因表达及菌体蛋白质谱的影响。方法 应用RCCS建立PA ATCC 27853模拟微重力培养体系，实验组旋转瓶轴心与地面平行模拟微重力环境，对照组即重力组旋转瓶轴心与地面垂直；采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测cDNA样本中毒力编码基因外毒素(toxA)、弹性蛋白酶(lasB)、鼠李脂糖(rhlA)、绿脓菌素(phza2)mRNA的相对含量；利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术及CM10芯片检测PA菌体蛋白质谱。结果 RCCS模拟微重力处理14 d后，Real-time PCR检测实验组cDNA样本中toxA、lasB、rhlA、phza2 毒力编码基因相对含量均低于对照组(P<0.05)；表面增强激光解吸电离飞行时间质谱检测发现有82种小分子菌体蛋白质[荷比在(2～20)×103Da范围内]，两组42种菌体蛋白相对含量表达差异有统计学意义，实验组20种蛋白质相对含量表达高于对照组，22种蛋白质相对含量表达低于对照组(P<0.05)。结论 RCCS模拟微重力培养条件下PA毒力编码基因表达和菌体蛋白质谱发生显著变化。

失重模拟；铜绿假单胞菌；基因表达；蛋白质谱

随着载人航天事业的迅猛发展，太空感染问题亟待深入研究。研究表明，微重力环境不仅导致细菌生物学性状改变，而且能够改变机体各部位的菌群构成[1-2]。同时，微重力作为一种特殊的应激原，能够抑制机体的非特异性免疫系统[3]。随宇航员和飞行器进入太空的微生物时刻威胁着宇航员的健康及飞行器的安全[4]。铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginos， PA)是一种常见的条件性致病菌，易引起免疫功能低下人群急性感染，并容易产生耐药性，导致实质性组织损伤、系统性蔓延、败血症甚至死亡[5]。阿波罗13号宇宙飞船执行任务途中，曾有宇航员发生PA引起的泌尿系统感染[6]。有学者研究发现，模拟微重力环境下经口腔灌注PA的大鼠死亡率显著增加，死亡时间明显缩短，皮质醇水平上升，且器官清除细菌能力显著降低[7]。本文使用三维细胞培养系统(RCCS)建立PA模拟微重力培养体系，研究模拟微重力环境对PA菌毒力编码基因表达和菌体蛋白质谱的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：PA ATCC 27853标准菌株(中国普通微生物菌种保藏管理中心)。

1.1.2 主要试剂：LB培养基，MH肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)；Trizol提取试剂盒(上海生工技术服务有限公司)；第一链cDNA合成试剂盒(上海生工技术服务有限公司)；Sybr Green PCR Master Mix(美国Applied Biosystem公司)；管家基因(16S)、toxA、lasB、phzA2、rhlA引物(上海生工技术服务有限公司)；CM10芯片(美国Ciphergen公司)。

1.1.3 主要仪器：RCCS(美国Synthecon公司)；PCR反应扩增仪(美国Applied Biosystem公司)；DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)；StepOne型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystem公司)；超声波细胞粉碎仪JY 92-2(上海新诺仪器设备有限公司)；蛋白芯片质谱仪PBSⅡ-C(美国Ciphergen公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模拟微重力细菌培养：参照文献[8]，PA增菌培养至对数生长期，调整菌液终浓度为103cfu/ml；浸洗细胞培养瓶10 min，弃废液，加注菌液，排空气泡，安置培养瓶于RCCS上。实验组(模拟微重力组)培养瓶轴心与地面平行，对照组(地面重力组)培养瓶轴心与地面垂直，25 r/min、37℃恒温条件下持续培养PA，每24 h更换培养基，收集培养14 d后实验组与对照组的PA菌体。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测毒力编码基因外毒素A(toxA)、弹性蛋白酶(lasB)、鼠李脂糖(rhlA)和绿脓菌素(phza2)mRNA表达：①引物设计：引物序列引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，见表1。②总DNA提取：取1 ml菌液离心，弃上清；加1 ml 1×TE吹打混匀，离心至8000 r/min，弃上清；重复步骤2后，加入溶菌酶和溶葡球菌酶各100 μl，震荡混匀，37℃水浴1 h。Trizol法提取细菌总RNA，琼脂糖凝胶电泳检验提取总RNA，BIO-RAD凝胶成像系统照相。③反转录合成cDNA第1链：采用第1链cDNA合成试剂盒，将提取的总RNA经二步法反转录合成cDNA。④Real-time PCR法检测：Real-time PCR反应体系由SybrGreen PCR Master(2X)、forward primer、reversed primer、ddH2O和cDNA template组成。扩增反应在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪上进行，基因扩增条件：2 min 95℃(Hold)，10 s 95℃(Melt)，40 s 60℃(Anneal/Extend)，40个循环。反应结束后，联机生成标准曲线。

表1 PCR引物及扩增产物

注：toxA为外毒素A，lasB为弹性蛋白酶，rhlA为鼠李脂糖，phza2为绿脓菌素

1.2.3 表面增强激光解吸电离飞行时间质谱检测菌体蛋白质谱： ①提取蛋白： 收集实验组与对照组菌体，4℃预冷低盐PBS洗2次，加入1 ml裂解液，细胞破碎仪震荡10 s，冰浴20 s，震荡10 s，如此反复至累计震荡时间10 min。4℃离心，12 000 r/min，收集上清，即为菌体蛋白溶液。Bradford法定量蛋白，-80℃保存备用。②标本处理：取出样品冻融，以10 000 r/min，4℃，离心2 min；每个芯片点需要样品10 μl，将样品用2倍体积U9缓冲液稀释，冰浴震荡30 min；将30 μl上述样品与370 μl NaAc迅速混匀。③样品检测：CM10 型芯片安装于加样器上，在芯片处理器每孔中加入上述处理好的样品100 μl，置振荡器300 r/min，室温震荡孵育1 h。甩去样品，结合缓冲液洗2次。每孔加入HEPES(1 mmol/L，pH=4.0)200 μl，取出芯片，待干后，加SPA 0.5 μl 2次。自然干燥后，蛋白芯片阅读机进行蛋白质谱分析。④数据采集：将CM10芯片放入蛋白芯片质谱仪内读取菌体蛋白信息，用Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0 软件自动收集数据，设定采集条件，最高检测相对分子质量200×103，优化Mr范围2×103～20×103，计算机根据采集的数据绘制出蛋白质谱图。仪器每日用Ciphergen公司的ALL-INONE标准蛋白校正，控制系统质量偏差在0.1%内。

2 结果

2.1 Real-time PCR检测结果

2.1.1 RNA样品纯度：实验组与对照组总RNA凝胶电泳可见清晰的16 S和23 S两条带，在近加样孔处未见DNA条带。表明所提取RNA不存在基因组DNA污染，未被RNA酶降解。

2.1.2 Real-time PCR溶解和扩增结果： 两组toxA、lasB、rhlA、phza2基因Ct值均在18～30，与模板浓度具有良好的线性关系。熔解曲线显示，4个基因均只有一个特异峰，且峰形较锐利，提示扩增反应特异性良好，见图1(phza2为例)。扩增曲线显示，曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象，各管扩增曲线平行性良好，各反应管扩增效率相近，见图2(phza2为例)。

2.1.3 Real-time PCR检测结果： 采用2-△△Ct法对Real-time PCR数据进行整理分析，经RCCS模拟微重力处理后实验组lasB、phza2、rhlA、toxA mRNA表达水平分别为0.159±0.005、0.215±0.036、0.203±0.005、0.141±0.019，对照组分别为1.003±0.096、1.005±0.128、1.000±0.020、1.011±0.184。实验组低于对照组(P<0.05)，见图3。

2.2 菌体蛋白质图谱分析 PA菌体蛋白质图谱检测发现，菌体蛋白质荷比(M/Z)在(2～20)×103Da范围内共检出82个蛋白质峰，经实验14 d后，两组82个菌体蛋白质中有42个蛋白质相对含量比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中20个蛋白质实验组相对含量表达高于对照组(P<0.05)，见表2；22个蛋白质实验组相对含量表达低于对照组(P<0.05)，见表3；蛋白质表达峰形图见图4。

图1 绿脓菌素基因实时荧光定量聚合酶链反应熔解曲线

图2 绿脓菌素基因实时荧光定量聚合酶链反应扩增曲线

实验组培养瓶轴心与地面平行，模拟微重力；对照组培养瓶轴心与地面垂直

图3 两组毒力编码基因表达水平比较

实验组培养瓶轴心与地面平行，模拟微重力；对照组培养瓶轴心与地面垂直；与对照组比较，aP<0.05

表2 两组20个蛋白质相对含量比较

注：实验组培养瓶轴心与地面平行，模拟微重力；对照组培养瓶轴心与地面垂直；与对照组比较，aP<0.05

表3 两组22个蛋白质相对含量的比较

注：实验组培养瓶轴心与地面平行，模拟微重力；对照组培养瓶轴心与地面垂直；与对照组比较，aP<0.05

图4 两组蛋白质表达峰形图

A.箭头所指为实验组质荷比为6973 Da的蛋白质表达；B.箭头所指为实验组质荷比为7581 Da的蛋白质表达；实验组培养瓶轴心与地面平行，模拟微重力；对照组培养瓶轴心与地面垂直

3 讨论

PA在免疫功能低下及其他特殊情况下易导致急性或慢性感染，往往症状严重，预防及治疗十分困难[9-10]。Crabbé等[11-12]进行模拟微重力培养24 h和飞船搭载培养25 h研究发现，短期微重力培养后PA藻酸盐、LasB、rhlA产生增加，其中PA PAO1菌株涉及的多种应激反应蛋白合成、致病因子表达以及各种生理代谢物质合成等基因表达上调，致病性增强。Kim等[13]研究航天搭载连续培养72 h的PA PA14菌株，寡营养培养条件下比对照组菌株的细菌浓度更高。另有研究表明，模拟微重力处理后PA PAUG2菌株的生长曲线和膜极化值与对照组比较无显著差异[14]，PA PA103菌株的生长周期及外毒素产量也无显著差异[15]。

toxA、lasB、rhlA和phza2为PA的毒力编码基因[10-12]。本实验经RCCS模拟微重力处理14 d后，toxA、lasB、rhlA、phza2 mRNA的表达水平均较对照组降低，显示PA的致病力减低。这与文献报道结果不尽一致。本研究中RCCS模拟微重力时间为14 d，分析认为随微重力暴露时间的延长，PA对微重力环境可产生适应，多种应激反应蛋白、致病因子、各种生理代谢物质的表达合成会发生一系列变化，进而引起PA毒力因子表达下调。另外，实验结果的差异还可能与微重力具体环境和培养条件不同有关，但具体机制尚待进一步研究。

蛋白芯片质谱技术是将芯片概念与质谱技术相结合发展起来的一门新兴技术，具有能直接检测、特异性强、灵敏度高及自动化等优点，能够检测低丰度、相对分子质量低的蛋白质，主要适用于相对分子质量在(2～20)×103Da范围内的小分子蛋白质或多肽的筛选研究，该技术已用于航天医学领域的研究[16-17]。CM10是一种WCX芯片，能与表面带正电荷的蛋白质结合，如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，可以用来检测未知的表面带有正电荷蛋白质或多肽，多用于高等电点蛋白质的选择性分析和生物标记分子的检测，适用于PA菌体蛋白的蛋白质组学研究[18]。Crabbé等[11,19]研究发现，在模拟微重力环境下培养24 h，PA毒力蛋白lasB、rhlA及藻酸盐产量增加，但phza2的产量无明显变化。进一步研究发现，在模拟微重力环境下生物被膜的形成受剪切力的影响，在低剪切力作用下PA PAO1菌株形成黏稠的细胞聚集物，而在高剪切力作用下可形成稳固的生物被膜。另有研究发现，模拟微重力环境下PA可形成稳固的生物被膜，在剧烈振动条件下仍能稳固存在[20]。Kim等[21]研究证实，经亚特兰蒂斯号航天飞机太空搭载连续培养72 h后，PA生物膜数量增多、厚度增厚、生物膜上活细胞增多，且生物膜结构发生显著变化。本研究结果显示，经RCCS模拟微重力培养14 d后，CM10蛋白芯片检测出82个PA菌体小分子蛋白，其中42个蛋白质两组表达差异具有统计学意义，其中20个蛋白质实验组相对含量表达高于对照组，22个蛋白质实验组相对含量表达低于对照组，这说明微重力环境能够影响菌体代谢状态，刺激或抑制部分菌体蛋白合成及分解。分析认为，这些表达差异的蛋白质在失重应激与应激耐受或适应过程中可能发挥重要作用，包括影响PA生物被膜生成、多种毒力因子产生及宿主免疫防御系统能力受损等。

综上所述，随着空间探索事业的迅猛发展，研究太空感染问题、制定合理的防治措施已刻不容缓。据统计，曾执行过航天任务的742名宇航员中，共发生过29种感染性疾病，包括真菌感染、流感样疾病、尿路感染、病毒性肠胃炎和皮肤感染等，PA可随宇航员进入太空环境，是主要病原菌之一[22]。我们研究发现，RCCS模拟微重力条件下PA的生物学性状受到影响，毒力编码基因和蛋白质谱发生变化，具体机制尚待深入研究。

[1] Horneck G, Klaus D M, Mancinelli R L. Space microbiology[J].Microbiol Mol Biol Rev, 2010,74(1):121-156.

[2] Nefedov Y G, Shilov V M, Koustantinova I V,etal. Microbiological and immunological aspects of extended manned space flights[J].Life Sci Space Res, 1971,9:11-16.

[3] Baqai F P, Gridley D S, Slater J M,etal. Effects of spaceflight on innate immune function and antioxidant gene expression[J].J Appl Physiol, 2009,106(6):1935-1942.

[4] 黄玉玲,杨建武,易勇,等.微重力及太空飞行对微生物影响的研究进展[J].北京生物医学工程,2014,33(1):84-88.

[5] Savoia D. New perspectives in the management of Pseudomonas aeruginosa infections[J].Future Microbiol, 2014,9(7):917-928.

[6] Taylor G R. Recovery of medically important microorganisms from Apollo astronauts[J].Aerosp Med, 1974,45(8):824-828.

[7] Aviles H, Belay T, Fountain K,etal. Increased susceptibility to Pseudomonas aeruginosa infection under hindlimb-unloading conditions[J].J Appl Physiol(1985), 2003,95(1):73-80.

[8] 黄玉玲,易勇,杨建武,等.RCCS模拟微重力环境对铜绿假单胞菌莫西沙星敏感度的影响[J].医学研究杂志,2014，43(7):53-56.

[9] Sharma A, Krause A, Worgall S. Recent developments for Pseudomonas vaccines[J].Hum vaccin, 2011,7(10):999-1011.

[10]Veesenmeyer J L, Hauser A R, Lisboa T,etal. Pseudomonas aeruginosa virulence and therapy: evolving translational strategies[J].Crit Care Med, 2009,37(5):1777-1786.

[11]Crabbé A, Schurr M J, Monsieurs P,etal. Transcriptional and proteomic responses of pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen[J].Appl Environ Microbiol, 2011,77(4):1221-1230.

[12]Crabbé A, Pycke B, Van Houdt R,etal. Response of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to low shear modeled microgravity involves AlgU regulation[J].Environ Microbiol, 2010,12(6):1545-1564.

[13]Kim W, Tengra F K, Shong J,etal. Effect of spaceflight on Pseudomonas aeruginosa final cell density is modulated by nutrient and oxygen availability[J].BMC Microbiol, 2013,13:241.

[14]England L S, Gorzelak M, Trevors J T. Growth and membrane polarization in Pseudomonas aeruginosa UG2 grown in randomized microgravity in a high aspect ratio vessel[J].Biochim Biophys Acta, 2003,1624(1-3):76-80.

[15]Guadarrama S, Pulcini Ed, Broadaway S C,etal. Pseudomonas aeruginosa growth and production of Exotoxin A in static and modeled microgravity environments[J].Gravit Space Biol Bull, 2005,18(2):85-86.

[16]Sihlbom C, Kanmert I, Bahr Hv,etal. Evaluation of the combination of bead technology with SELDI-TOF-MS and 2-DDIGE for detection of plasma proteins[J].J Proteome Res, 2008,7(9):4191-4198.

[17]纪安来,张军,周金莲,等.微重力环境对大鼠血浆蛋白质谱影响的研究[J].生物技术通讯,2013,24(2):230-234.

[18]陈海荣,陈一强,温红侠.生物膜形成相关的铜绿假单胞菌蛋白质组学研究[J].中华医院感染学杂志,2010,20(6):751-754.

[19]Crabbé A, De Boever P, Van Houdt R,etal. Use of the rotating wall vessel technology to study the effect of shear stress on growth behaviour of Pseudomonas aeruginosa PA01[J].Environ Microbiol, 2008,10(8):2098-2110.

[20]McLean R J, Cassanto J M, Barnes M B,etal. Bacterial biofilm formation under microgravity conditions[J].FEMS Microbiol Lett, 2001,195(2):115-119.

[21]Kim W, Tengra F K, Young Z,etal. Spaceflight promotes biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa[J].PLoS One, 2013,8(4):e62437.

[22]Crucian B, Sams C. Immune system dysregulation during spaceflight: clinical risk for exploration-class missions[J].J Leukoc Biol, 2009,86(5):1017-1018.

Effects of Simulated Microgravity with RCCS on the Expression of Virulence Encoding Genes and Proteinic Profiles of Pseudomonas Aeruginosa Mycoprotein

HUANG Yu-ling1, XU Bing-xin2a, ZHANG Jun2a, DUAN Yu-zhong2b, YANG Jian-wu2b, ZHOU Jin-lian2c, DONG Man-ku2b, LI Cheng-lin2b, CUI Yan2b

(1. Department of General Surgery, the People's Hospital of Daxing District, Beijing 102600, China; a. Department of Special Medical Laboratory Center, b. Department of General Surgery, c. Department of Pathology, 2. 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To investigate the effects of simulated microgravity with the rotary cell culture system (RCCS) on the expression of virulence encoding genes and proteinic profiles of Pseudomonas aeruginosa (PA) mycoprotein. Methods The cultured system of PA ATCC 27853 under simulated microgravity were established using RCCS, and the control group was oriented to achieving normal earth gravity, while experiment group simulated microgravity. The relative contents of toxA, lasB, rhlA and phza2 mRNA virulence encoding genes in cDNA samples were detected by real-time PCR (polymerase chain reaction) method. The PA tropina profiles were detected using the surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry and CM10 chip. Results After being cultured for 14 d, the relative contents of toxA, lasB, rhlA and phza2 mRNA virulence encoding genes in cDNA samples were significantly lower than those in control group by real-time PCR detection (P<0.05); 82 types of micromolecule tropina from 2×103to 20×103dalton range were discovered by surface-enhanced laser desorption-ionization time-mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) method in control and experiment groups; the differences of 42 types of micromolecule tropina expressions of relative contents in the two groups were statistically significant, and 20 types expressions of relative contents in the experiment group were higher than those in control group, and 22 types' expression of relative contents were lower than those in the control group (P<0.05). Conclusion The expression of virulence encoding genes and proteinic profiles of PA mycoprotein can be effectively affected after being cultured by RCCS simulated microgravity.

Weightlessness simulation； Pseudomonas aeruginosa； Gene expression； Proteinic profiles

全军医学科研“十二五”重点项目(BWS11J051)

102600 北京，北京市大兴区人民医院普通外科(黄玉玲)；100101 北京，解放军306医院特种医学实验研究中心(徐冰心、张军)，普通外科(段育忠、杨建武、董满库、李成林、崔彦)，病理科(周金莲)

崔彦，E-mail：dryancui@aliyun.com；董满库，E-mail：dongmanku1126@sina.com

R378.991；R856

A

2095-140X(2015)06-0001-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.001

2015-02-27 修回时间：2015-03-20)