N lrp9b在小鼠不同组织中的表达和定位

刘 芳，江 宁，肖 琼，孙惠文，彭 辉，张文昌

（福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）

N lrp9b在小鼠不同组织中的表达和定位

刘 芳，江 宁，肖 琼，孙惠文，彭 辉，张文昌

（福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）

利用RT-PCR、免疫印迹和免疫组化方法研究Nlrp9b基因在小鼠不同组织中的表达和定位。结果Nlrp9b的转录物和蛋白只在小鼠的卵巢和小肠中表达；在卵巢中，NLRP9B蛋白主要在卵母细胞中定位；在小肠中，该蛋白主要定位在小肠的上皮细胞。表明Nlrp9b转录物和蛋白在小鼠中的表达和定位预示着该基因可能在小鼠的生殖系统和免疫系统中发挥一定的生理功能。

Nlrp9b；表达；定位；小鼠

Nlrp（nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing pro⁃teins）基因家族分别在生殖系统和免疫系统发挥重要功能［1-3］。目前研究证实，灵长类上Nlrp1、Nlrp3、Nlrp6、Nlrp10和Nlrp12均为免疫相关基因，而Nlrp2、Nlrp4、Nlrp5、Nlrp7、Nlrp8、Nlrp9、Nlrp11、Nlrp13、Nlrp14这些基因均为生殖相关基因［4］。在小鼠上Nlrp7、Nlrp8、Nlrp11和Nlrp13可能在进化的过程中丢失而未被发现［4］。由于小鼠Nlrp基因家族存在谱系特异性复制，所以存在Nlrp9a、Nlrp9b和Nlrp9c这3个基因，有研究发现Nlrp9a和Nlrp9c只在小鼠卵母细胞中表达，但是对小鼠早期胚胎发育并没有影响［5］，所以我们推测Nlrp9b基因可能在小鼠胚胎发育过程中起到关键性的作用。本试验旨在确定Nlrp9b基因的表达和定位，为进一步探讨Nlrp9b基因的功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物试验ICR雌鼠来源于福建医科大学实验动物中心，饲养在光照周期为14/10 h（白天/黑夜）的室内，温度控制在25℃±1℃，相对湿度在50%～60%。

1.2 总RNA的提取和cDNA的合成将试验小鼠饲养至4周龄处死，并迅速取下不同组织，包括卵巢、小肠、睾丸、肺、心脏、肝、脑、胃、脾脏和肌肉，并分别置于液氮中研磨，在每个研磨后的样品中各取50～100 mg，分别放入1.5 m L的离心管中，在冰盒上向离心管中加入1mL TRIZol试剂进行抽提组织RNA，测量提取出来的RNA的OD值并记录RNA浓度。采用PrimeScript II 1st Strand cD⁃NA Synthesis Kit合成组织cDNA。

1.3 RT-PCR所用引物如表1，先利用普通RTPCR确定最佳退火温度，并确定扩增产物的长度且没有非特异性扩增。

PCR反应体系为25μL体系，其中的混合液如表2所示。

表1 基因特异性引物序列

表2 PCR反应体系

将反应体系轻轻摇匀并瞬离，在PCR仪中进行cDNA扩增，PCR的反应参数为：95℃预变性1 min，94℃30 s，57℃/60℃30 s，72℃25 s，扩增35个循环。反应结束后取出PCR反应产物用浓度2%（m/v）琼脂糖凝胶电泳，之后取出胶在凝胶成像仪下照相并分析。

1.4 Western Blot取雌鼠的等量的不同组织，包括卵巢、小肠、睾丸、肺、心脏、肝、脑、胃、脾脏和肌肉，分别在组织裂解液中裂解，将研磨混合液吸出放入1.5 mL离心管中，10 000～14 000 r/min（4℃）离心10min，取上清液。之后加入适量蛋白上样缓冲液，100℃煮10min。用8%SDS-PAGE电泳将其蛋白分离，每个泳道加入等量蛋白样品。利用湿转方法将蛋白转到NC膜上，使用含5%脱脂奶粉的TBS在室温下封闭4 h，之后将NC膜置入1∶1 000稀释的一抗溶液中4℃孵育过夜。然后TBS洗涤膜3次，每次10 min，置于辣根过氧化物酶标记的1∶1 000稀释的二抗中孵育2 h，用TBS洗涤3次，每次10min。用增强型化学发光的蛋白质印迹检测试剂盒检测NLRP9B蛋白并在暗室曝光。β-actin的检测方法同上并作为对照。

1.5 免疫组化取6周龄小鼠的卵巢和小肠用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片约6μm厚度。这些切片经过二甲苯中脱蜡、梯度酒精再水化后，置入10mmol/L枸橼酸钠中在微波炉中进行抗原修复（中火，15 min），之后自然冷却到室温。免疫组化染色方法是链霉素-生物素法（SP法），首先将切片用10%非免疫羊血清封闭，然后用NLRP9B抗体在4℃过夜孵育（1∶200稀释）。经过多次冲洗之后，加入生物素化的羊抗兔二抗，室温孵育10min，之后再用抗生蛋白链菌素链接的碱性磷酸酶和BICP/NBT底物检测目的蛋白。对照试验中除了不加一抗，其他所有操作步骤与正常试验相同。将切片分别用封片液封片，再用显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 Nlrp9b转录物和蛋白在小鼠不同组织中的表达为了研究Nlrp9b转录物和蛋白在小鼠10种不同组织中的表达情况，我们分别进行了RTPCR和免疫印迹（WB）分析。结果如图1所示，RT-PCR的分析表明，Nlrp9b的转录物只在小鼠的卵巢和小肠中检测到，在其他的组织中检测不到Nlrp9b的表达。同样，免疫印迹的试验结果与RT-PCR的分析结果一致（图2）。

图1 N lrp9b基因在小鼠10种不同组织中的表达水平M：Marker对照；OV：卵巢；In：小肠；Te：睾丸；Lu：肺；He：心；Li：肝；Br：脑；St：胃；Sp：脾脏；Mu：肌肉；Hprt1为内参

图2 NLRP9B蛋白在小鼠10种不同组织中的表达水平

2.2 NLRP9B蛋白在小鼠卵巢和小肠中的定位

Nlrp9b基因只在小鼠的卵巢和小肠中表达，为了研究NLRP9B蛋白在这两种组织中的定位，我们进行了免疫组织化学分析。结果表明，在卵巢中，NLRP9B蛋白在不同时期卵泡的卵母细胞中定位。在小肠中，NLRP9B蛋白在小肠黏膜上皮细胞中存在（见中插彩版图3）。

3 讨论

本试验通过RT-PCR和免疫印迹方法发现，Nlrp9b转录物和蛋白均在小鼠卵巢和小肠中表达，并且利用免疫组化证实这一结果。Nlrp基因家族主要在生殖系统和免疫系统中起重要作用。研究表明，Nlrp2和Nlrp5只在卵巢组织中表达［6-9］，Nlrp8、Nlrp9和Nlrp14在卵巢和睾丸中均有表达［7、10］，说明这些基因均与动物的生殖相关。本试验结果显示，Nlrp9b基因也在卵巢中表达，并且只存在于卵母细胞，由此我们推测Nlrp9b基因有可能参与小鼠的早期胚胎发育。为了证实该推断，后期我们会进一步研究Nlrp9b基因的具体功能。

本研究发现Nlrp9b基因不仅在小鼠卵巢中表达，还在小肠中检测到该基因的转录物。彭辉等［5］研究Nlrp9a和Nlrp9c基因时发现这些基因只在卵巢组织中表达，这说明Nlrp9b基因的表达模式与Nlrp9a和Nlrp9c的不同。有研究发现，Nlrp12基因也在小肠中表达，小鼠缺失该基因会表现出明显的炎症反应［11-12］，说明该基因参与了免疫应答反应，所以我们推测Nlrp9b基因不仅在生殖系统中起一定作用，还可能在小肠发生或肠黏膜免疫方面发挥功能。免疫组化的结果显示，Nlrp9b蛋白定位在小肠黏膜上皮细胞，吴翰桂等［13］研究表明，小肠粘膜由于含有上皮淋巴细胞而具有免疫功能，这进一步说明Nlrp9b基因可能参与了小肠的黏膜免疫。彭辉等［14］对免疫相关基因Nlrp1a、Nlrp1b、Nlrp1c、Nlrp3、Nlrp6、Nlrp10和Nlrp12做了充分的研究，结果表明，这些免疫相关基因的表达位置不尽相同，说明这些基因的功能存在差异。因此，Nlrp9b基因的功能也可能与其他的免疫相关基因不同。

4 结论

Nlrp9b基因分别在小鼠的卵巢和小肠表达，预示着该基因可能在生殖系统和免疫系统中发挥一定的生理功能。

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Expression and Localization of Nlrp9b gene inmouse different tissues

LIU Fang，JIANGNing，XIAOQiong，SUN Hui-wen，PENGHui，ZHANGWen-chang
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

The expression and localization of Nlrp9b gene in different tissues ofmouse was investigated by RT-PCR，western blotand immunohistochemistry analysis.The results indicated that the expression of Nlrp9b transcripts and protein was detected in ovary and intestines.Nlrp9b protein was located in oocytes of different follicles in the ovary and in epithelial cells of small intes⁃tine.In conclusion，the expression and localization of Nlrp9b gene suggest that this gene plays a role in reproductive system and im⁃mune system in themouse.

Nlrp9b；expression；localization；mouse

ZHANGWen-chang

S865.1+3

A

0529-6005（2015）12-0030-03

2015-07-21

国家自然科学基金青年基金（31402079）；福建省自然科学基金（2014J01071）

刘芳（1989-），女，硕士生，研究方向为动物生殖生理与胚胎工程，E-mail：1071051602@qq.com

张文昌，E-mail：zwcfz@163.com