有机相中脂肪酶的催化反应及其应用

刘珊珊，刘 鹏，周玲妹，柳志强，郑裕国

（浙江工业大学 生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

脂肪酶是最早应用于非水相生物催化的酶之一。近年来，绝大部分商品化脂肪酶如Novozym 435、Lipozym等都来源于微生物。脂肪酶能够催化水解、酯化、转酯化、多肽合成等反应，它的催化活性高、底物谱广泛，无论在酶学理论研究和实际工业生产领域，都受到广泛关注。随着非水酶学的发展，进一步推动了脂肪酶在各领域中的应用。有机溶剂是一种主要的非水介质，广泛应用于生物催化反应。有机相中脂肪酶催化的研究主要开始于20世纪80年代，美国麻省理工学院Zaks和Klibanov教授为首的研究小组对有机相介质中脂肪酶的催化行为及热稳定性进行了系统研究。目前，有机溶剂中脂肪酶的催化反应已广泛应用于油脂加工、食品、医药、新能源等领域。但游离的脂肪酶在有机相中的应用仍受到限制，在有机相中脂肪酶的活力和稳定性一般会下降，游离酶容易发生聚集，单个酶分子不能与底物作用，从而影响反应速率，限制了其在工业化领域的应用。为了提高脂肪酶在有机相中的催化性能，固定化是一种简单有效的手段，可有效避免游离酶的自聚和分解。脂肪酶还存在界面激活效应，疏水性载体或表面活性剂可以改变脂肪酶分子的构象，相比游离酶，固定化脂肪酶的催化活力和稳定性会有很大的提高。本文对脂肪酶在有机相体系中的催化反应、固定化方法及其应用做了简要概述。

1 脂肪酶在有机相中的催化反应

酶作为主要的生物催化剂，具有特定功能的酶的开发是促进现代工业生物技术发展的基础。有机相中脂肪酶催化性能的发现打破了生物催化反应必须在水相中进行的传统理念，开拓了生物酶广阔的应用前景。

相对于传统的水相催化，将有机溶剂体系应用于工业化生产有着绝对的优势。酶在有机相中可以催化传统化学难以催化的反应，可增大疏水性底物的溶解度，提高有水生成反应的产率，抑制有水参与的副反应发生，底物的专一性和选择性包括区域选择性和对映体选择性均大大提高，同时有机相催化对酶的固定化要求不高，后续产物分离过程容易。因此人们逐渐重视非水相酶催化被并进行了大量且卓有成效的研究，目前已经报道的能在非水相中进行催化反应的酶包括多种：如蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、过氧化氢酶、醛缩酶、醇脱氢酶等，其中研究最为深入和广泛的是脂肪酶。脂肪酶具有多种催化能力，能够催化水解、酯化、酯交换、醇解和酸解等一系列的反应，且具有催化效率高、催化稳定性好、底物专一性高以及底物谱广等优点。不同来源的脂肪酶往往具有不同的底物特异性、催化活力和催化特性，但其立体结构都具有一个α/β折叠结构、催化结合位点和氧负离子疏水通道，不同的脂肪酶二级结构在经典的α/β水解酶结构的基础上加以变化，活性中心Ser残基通常被一个α螺旋“盖子”覆盖，“盖子”的存在导致底物很难靠近催化活性中心，造成脂肪酶催化效率的下降。覆盖脂肪酶活性中心的“盖子”其外表面相对亲水，面向活性位点的内表面则相对疏水，当酶处于闭合状态时这个盖子会把活性位点覆盖，当处于油水界面时，这个盖子会被移开，酶的活性被激发。在有机相体系中，脂肪酶的催化结合位点保持着与水相体系相似的完整三维立体结构，由于有机相体系中存在少量的水，形成油水两相界面，脂肪酶发生界面激活作用，可以催化在水相中不能进行的酯化和转酯化等反应。

2 脂肪酶有机相催化的影响因素

有机相介质中脂肪酶催化反应的研究已取得了突破性的进展，脂肪酶在一些特定的有机相体系中能够保持较高的催化活性和稳定性，但是对有机溶剂中酶促反应机理的认识还不够透彻，仍然局限于非水环境中微环境对酶的活性及稳定性的影响。根据大量的实验结果，有机相中脂肪酶催化活性和稳定性的维持除了受酶本身的影响外，体系中含水量、有机溶剂的性质都是重要的影响因素[1]。

2.1 水含量对脂肪酶有机相催化的影响

水是决定有机相中生物催化反应效率的一个重要因素，脂肪酶的生物催化活力、稳定性及特异性与反应体系中的含水量密切相关。有机相中的微量水主要以两种形式存在，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是溶于有机相的游离水。与酶分子紧密结合的结合水使酶分子的周围形成一层水化层，对酶的催化活性至关重要；与酶蛋白紧密结合的这一单层水分子称为“必需水”，通过氢键、范德华力等非共价键间的相互作用来维持酶的活性构象，影响酶的催化活性。从微观上看有机溶剂中酶的生物催化反应并不是在绝对没有水存在的情况下发生的，而是一种微水相反应。通过对酶必需水的调控，可以调节有机相酶催化反应的催化活性。同时，水的存在也可能导致酶的“热失活”，降低酶催化的稳定性，在有水生成的可逆反应中如酯化反应，水也会对热力学平衡产生影响，对产物的生成造成不利影响。因此水是酶在有机相中进行催化反应所必需的，只有在最适含水量的条件下，酶才能表现出最高的活力。Zaks等[2]的研究表明有机相中含有微量的水对酶活性的维持至关重要。Herbst等[3]研究了在正己烷和四氢呋喃混合有机相体系中，通过向体系中加水的方式考察水含量对Candida rugosa脂肪酶催化转酯化反应的影响，水的加入增加了酶的柔性，提高了底物转化率，继续增加水含量，酶发生聚集，导致酶活力降低。

2.2 有机溶剂的性质对脂肪酶有机相催化的影响

有机溶剂能直接或者间接地影响酶的活力与稳定性，通常用log P值表征有机溶剂的疏水性与酶的催化反应活性，log P值指某物质在正辛醇（油）和水中的分配系数比值的对数值。以有机溶剂为非水相体系，根据有机溶剂的log P值，可选择合适的非水相体系，log P值越小溶剂的疏水性小，能够夺取脂肪酶分子表面的必需水，从而使脂肪酶活力降低甚至导致酶失活；log P值越大则溶剂疏水性越大，疏水性大的有机溶剂对脂肪酶分子必需水夺取较少，从而保持了脂肪酶分子的完整性，脂肪酶往往更加稳定，但不利于底物和产物在水化层的扩散，影响底物与脂肪酶活性中心的接触，使生物催化反应受到抑制。此外，有机溶剂还可能与脂肪酶分子直接发生作用，有机溶剂分子通过与脂肪酶分子间的相互作用使脂肪酶分子的氢键或疏水键等发生改变从而改变脂肪酶分子的构象，影响脂肪酶的催化活力。一般情况，脂肪酶催化的酯化与转酯化反应所选择的有机溶剂的log P值为2～5，在这个范围内脂肪酶催化的反应容易获得最佳反应条件，酶与底物间的作用更加灵活。Chen等[4]研究了不同疏水性的有机溶剂对Candida cylindracea脂肪酶催化合成丁酸乙酯的影响，结果表明游离和固定化的脂肪酶分别在正戊烷（log P=3.2）和正己烷（log P=3.5）体系中获得最高的产率。Yin等[5]采用固定化Candida sp.脂肪酶催化合成维生素A酯类衍生物，考察6种不同疏水性的有机溶剂对维生素A醋酸酯转酯化合成维生素A棕榈酸酯的影响，在正己烷 （log P=3.5）、异辛烷（log P=4.5）和石油醚（log P=3.0）三种有机相体系中可以获得较高的产率，在叔戊醇（log P=1.15）体系中维生素A棕榈酸酯的产率仅为8.4%。

3 脂肪酶的固定化

3.1 脂肪酶固定化的概述

脂肪酶作为一种特殊的生物催化剂，已被广泛应用于有机介质的生物催化反应，其固定化技术是得以工业化应用的关键因素。脂肪酶的固定化就是通过物理或化学方法将脂肪酶与载体相结合，使其不溶于含有底物的相，从而使脂肪酶被集中或限制在一定的空间范围内进行催化反应。固定化脂肪酶不仅具有一般固定化酶共有的优点，可有效避免游离酶的自聚和分解、稳定性高、易回收和可重复利用等，同时脂肪酶的突出特点是具有界面激活作用，在油水界面上催化活力增强，疏水性载体或表面活性剂可使酶分子构象发生改变，覆盖脂肪酶催化活性位点的“盖子”被打开，脂肪酶的活性可显著提高。游离的脂肪酶遇高温、高盐、强酸、强碱等稳定性差、易失活，在脂肪酶的固定化过程中应尽可能避免会破坏酶蛋白高级结构的因素，且脂肪酶的固定化成本不宜过高，以利于工业化应用。目前，脂肪酶固定化方法的改进主要体现在两个方面，一是固定化载体的设计、制备和选用；二是载体固定化脂肪酶所用的方法技术。

3.2 脂肪酶的固定化方法

脂肪酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。采用物理法进行脂肪酶的固定化的优势在于酶不参加化学反应，其整体结构保持不变，酶的催化活性被保留，但是由于存在一定的空间位阻，对一些反应不适用；化学法使用交联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，或者通过化学键将酶连接到天然的或者合成的高分子载体上，而形成相对分子量大、不溶性的固定化酶。由于脂肪酶具有特定的结构特征，在利用吸附法和包埋法制备固定化脂肪酶时通常使用表面具有一定疏水性的载体，由此制备的固定化酶活力会有较大的提高。

3.2.1 吸附法固定化脂肪酶

吸附法是利用氢键、范德华力、疏水作用或离子键等相互作用力将酶直接吸附到水不溶性载体表面上，吸附条件温和，酶蛋白的活性中心不易受到破坏且酶的高级结构没有明显变化，酶活力损失较小，但是酶与载体间的作用力较弱，酶容易从载体表面脱落，重复利用率低。目前固定化脂肪酶多用于非水相催化反应，脂肪酶在有机溶剂中不同于在水中，脂肪酶与载体间的作用力不需要很强，因此吸附法最常用于非水相反应体系固定化脂肪酶的制备。Kharrat等[6]用硅胶为载体物理吸附Rhizopus oryzae脂肪酶（ROL），与游离酶相比，所得的固定化酶热稳定性、非极性有机溶剂耐受性、储存稳定性及最适pH范围都有明显的提高，重复使用12个批次后固定化酶的催化活力没有明显降低。Hernandez等[7]采用Diaion HP20LX和MCI GEL CHP20P两种商品化多孔苯乙烯-二乙烯基苯微球为载体对南极假丝酵母脂肪酶B进行简单有效的固定化，比较了不同载体对脂肪酶固定化的影响，并同商品化脂肪酶Novozym 435相比较，结果表明，以MCI GEL CHP20P为载体，酶蛋白吸附量是decaoctyl Sepabeads载体的两倍，CALB-MCI GEL CHP20P固定化酶显示了优异的应用性能。

3.2.2 包埋法固定化脂肪酶

包埋法是将酶包埋在一定的微小空间内，以疏水性有机硅烷为前体采用溶胶凝胶法包埋脂肪酶是应用较广泛的一种固定化方法，此外也有将脂肪酶包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中的报道。包埋法操作简单，对酶活影响较小，制备的固定化酶强度较高，使用相同的固定化材料溶胶凝胶包埋法制备的固定化酶较吸附法具有更好的操作稳定性。1996年，Reetz等[8]首次采用疏水性的甲基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅、丙基三甲氧基硅烷及聚二甲基硅氧烷等为前体溶胶凝胶包埋法固定化脂肪酶。由于脂肪酶特殊的 “界面激活”性质，所制备的固定化酶其酶活大约是游离酶的10倍，研究者还发现固定化酶的储存稳定性及操作稳定性都有明显提高。2013年，Hu等[9]以正丙基三甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷为前体采用溶胶凝胶包埋法对Candida rugosa脂肪酶进行固定化并用于维生素E琥珀酸酯的合成，用橄榄油作为表面活性剂，固定化酶催化维生素E琥珀酸酯合成的酯化活力是游离酶的6.7倍。

3.2.3 交联法固定化脂肪酶

交联法是使用双功能或多功能试剂进行酶与载体之间或酶分子间的交联，从而得到三维交联网架结构，实现脂肪酶的固定化。戊二醛、联苯、双偶氮二联苯胺和六甲基二异氰酸等都可作为交联剂，其中戊二醛是最常用的一种交联剂。在大多数情况下，酶分子基团参与形成共价键实现酶的固定化，该方法容易引起酶活力损失，甚至可导致酶蛋白变性。在固定化中，交联法一般不单独使用，通常作为吸附法或包埋法的辅助手段，避免固定化酶的脱落。无载体固定化酶技术是一种新的酶固定化方法，其主要也是通过交联法制备，研究最广泛的有交联酶晶体技术（CLECs）和交联酶聚集体技术（CLEAs），无载体固定化酶技术是一种很有前途的固定化方法。Torres等[10]用无载体固定化方法—交联酶聚集体技术（CLEAs）对来源于Thermomyces lanuginosa的脂肪酶（TLL）进行固定化研究，以(NH4)2SO4作为沉淀剂，戊二醛作为交联剂，优化了制备交联TLL聚集体的条件，在最适条件下所得固定化酶的最高酶活力回收为75%。

3.2.4 共价结合法固定化脂肪酶

共价结合法是利用共价化学键实现酶蛋白分子上非必需的侧链基团与载体表面的功能基团进行结合的一种固定化方法。常用的载体包括纤维素、琼脂糖等天然高分子材料，聚丙烯酰胶、尼龙等人工合成高聚物和多孔玻璃、陶瓷等无机载体。共价结合法往往载体与酶结合牢固，稳定性好，有利于连续使用，但是共价结合反应条件苛刻，易破坏酶分子的活性中心，从而所得固定化酶活力不高。Chiou等[11]采用碳二亚胺偶联剂对壳聚糖载体进行活化，用于固定化Candida rugosa脂肪酶，研究结果表明，潮湿的壳聚糖颗粒作为载体具有更好的催化性能，用于棕榈酸对硝基苯酯的水解反应连续使用10个批次后酶活剩余85%。

4 有机相中脂肪酶催化技术的应用

4.1 脂肪酸酯的合成

脂肪酶作为一类可在有机相中催化酯合成、酯交换等反应的重要生物催化剂，其作用越来越受到国内外学者的重视，已广泛应用于化妆品、医药、及食品等领域。2003年刘长波等[12]使用不同脂肪酶作为生物催化剂，在有机相体系中催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯，确定了最佳的生物催化剂及生物催化反应体系。2008年李宏亮等[13]在含水量为0.2%的石油醚体系中催化合成了维生素A棕榈酸酯；2013年Jiang等[14]以Candida rugosa脂肪酶为生物催化剂，在有机介质中合成维生素E琥珀酸酯。

4.2 食品工业

在现代食品工业领域脂肪酶是不可或缺的生物催化剂，在油脂改性方面脂肪酶可催化一种酯与另一种脂肪酸、醇、酯发生酯交换反应，改变油脂的性质，Chang等[15]以正己烷为有机相催化反应体系，以氢化的棉籽油和菜籽油为底物，固定化脂肪酶催化两种底物进行转酯化反应，产物的熔点较天然可可脂高36°C，可作为可可脂的替代品；固定化脂肪酶也被用于芳香酯的合成，固定化Staphylococcus warneri和Staphylococcus xylosus脂肪酶被用于生产风味酯。

4.3 制药工业

近年来随着手性技术的兴起，脂肪酶催化工艺在医药领域中的应用成为最活跃的研究领域之一，脂肪酶的生物催化反应具有催化活性高，较强的专一性，较强的选择性，对环境没有污染等绝对的优势。在手性药物拆分上发现脂肪酶具有一定的优势，布洛芬、萘普生、酮洛芬等一系列抗炎镇痛类药物因为有手性中心存在对映体，对这一类药物进行生产工艺合成优化，取得了比较理想的效果。脂肪酶催化药物在抗菌药物、抗肿瘤药物和抗抑郁药物的合成方面也发挥了一定的作用。

4.4 新能源

以脂肪酶为生物催化剂可用于生物柴油的合成，由动植物油脂与短链的醇（甲醇或乙醇）通过脂肪酶进行酯交换反应得到脂肪酸单烷基酯，最常用的脂肪酶来源于Pseudomonas cepacia。王学伟等[16]利用自制的酶柱反应器，以大豆油和甲醇为底物，在固定化脂肪酶催化下进行酯交换反应，成功制备得到生物柴油，对合成工艺条件进行了优化，产物中主要脂肪酸甲酯的含量可以达到91.87%。但是在含有高浓度甲醇的反应体系中，脂肪酶往往易失活，限制了酶在生物柴油工业生产上的应用，因此耐极性有机溶剂脂肪酶的筛选成为一个研究方向和热点。

5 展望

有机相中脂肪酶的生物催化反应已成为非水酶学领域的一个重要分支，并在医药、食品等生产领域进行了广泛应用[17]。虽然将脂肪酶运用于有机相中的生物催化反应具有多种优势，但是有机溶剂对酶活及酶稳定性的不利影响仍然存在，基于基因组学和蛋白质组学的耐有机溶剂脂肪酶的筛选及改造已逐渐成为研究的热点，将有力促进脂肪酶在有机相合成中的应用。另外，脂肪酶的固定化除了传统固定化方法的应用，开发新的固定化技术也将推动有机相催化反应在工业生产中的广泛应用。

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