氨基酸发酵工业中原料替代的思考

李燕军，范晓光

（天津科技大学 生物工程学院，天津 300457）

目前全球氨基酸及其衍生物的种类已经超过1000种，全世界氨基酸年产量达600多万吨，其中谷氨酸及其盐产量约为300万吨，排名第二的赖氨酸产量也超过100万吨。全球行业分析公司（GIA）发表的《氨基酸：全球战略经营报告》预测，到2015年全球氨基酸市值将达116亿美元，并以每年6%的速度递增。我国氨基酸总产量超过300万吨，成为氨基酸产品的“世界工厂”。目前我国氨基酸发酵采用的原料主要为粮食淀粉，包括玉米、小麦等，每生产1 t氨基酸约消耗1.25 t折纯淀粉。

近年来，全球人口不断增加，使得粮食需求大增。联合国粮农组织（FAO）预测，到2050年全球人口将增加23亿，粮食需求将增长70%，而近十年来，粮食产量年增长率仅为0.5%，供需缺口明显增加。此外，美国推行的生物乙醇计划导致世界范围内粮食供给减少，进一步拉大供需缺口。目前我国有13亿多人口，预计到2020年将达到16亿，每年需净增粮食500万吨，而耕地、水资源等生产条件的约束却日益突出，粮食进一步增产的难度加大，未来粮食需求大于供给，粮食安全面临严峻的挑战。根据FAO公布的数据，2013年我国进口谷物的总量达到2800万吨，为世界上最大的粮食进口国。为此，中央“十二五”规划指出要把保障粮食安全作为首要目标，粮食安全是经济安全、社会稳定面临的长期挑战和战略课题。

为了应对国家粮食战略需求，从长远发展考虑，氨基酸发酵工业需不断开发非粮植物原料。非粮原料可以大致分为富含糖类植物、富含淀粉类植物和木质纤维素类植物。

1 非粮发酵替代原料

1.1 糖类植物

富含糖类植物主要有甘蔗、甜菜和甜高粱。目前，甘蔗和甜菜制糖工业的副产物糖蜜作为氨基酸发酵的碳源已经被广泛使用。

甜高粱（Sorghum bicolor L.Moench）是禾本科高粱属一年生草本植物，是高粱的一个变种。从海南岛至黑龙江都可以种植甜高粱，每公顷甜高粱能够产出2250～6000 kg粮食和60～75 t富含糖分的茎秆。甜高粱由于抗逆性强，可以在边际性土地上种植，不与粮争地。另外，甜高粱籽粒本身就是粮食，将一部分耕地种植甜高粱不会影响我国的粮食安全。甜高粱作为生产燃料乙醇的原料已经受到广泛的关注，早在“七五”计划就被列为国家重点科技攻关课题。然而，甜高粱茎秆中的糖分不耐储存，成为制约其普遍应用的瓶颈。笔者认为，利用甜高粱汁液发酵氨基酸可以借鉴丹麦AgroFerm公司的成功经验。在丹麦，饲料加工商在将绿色牧草（包括黑麦、三叶草和苜蓿等）干燥成粒之前，为了降低能耗，往往先用蒸汽加热牧草至80°C左右，然后将部分汁液挤出。丹麦一年能产生大约20万立方米这样的黄色汁液，干物质含量约为6%，其中含33%的糖类物质和26%的蛋白[1]。为了便于黄色汁液的储运，接种乳酸菌，如唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）进行乳酸发酵，汁液中所有糖类都被转化成乳酸，pH降至4.0～4.5之间，能够在厌氧条件下稳定保存。这种乳酸液是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）优良的发酵底物，其中的乳酸等有机酸和氨基酸很容易被谷氨酸棒杆菌利用。并且，由于乳酸菌已经将谷氨酸棒杆菌不可利用的成分转化为可发酵的小分子物质，利用酸液发酵能够产生更高浓度的菌体和产物[2]。AgroFerm公司利用这种酸液年产赖氨酸1.25万吨，基本能够满足丹麦市场的需求。除甜高粱外，玉米采收后的青秸秆、芒草和柳枝稷等高生物量青草也可以采用此法发酵生产氨基酸。

1.2 淀粉质原料

淀粉是植物体内贮藏的高分子碳水化合物，它可以分解成葡萄糖、麦芽糖等成分。富含淀粉的植物种类很多，我国约有400多种。下面介绍几种较重要的淀粉资源：木薯、橡子、葛根和魔芋。

木薯（Manihot esculenta Crantz）属大戟科木薯属植物，是灌木状多年生木质作物，与马铃薯、红薯并称世界三大薯类。由于我国粮食安全的重要性，薯类作物中，木薯被认为是当前较适宜种植在华南边际性土地的非粮作物。木薯淀粉水解糖在我国广西、东南亚国家如泰国、老挝、柬埔寨、越南、缅甸等被广泛应用于氨基酸发酵工业[3]。早在上世纪70年代，广西轻工业科学技术研究院就以木薯淀粉糖和糖蜜为原料发酵生产赖氨酸，在南宁、梧州分别建立了20 m3、30 m3发酵罐的赖氨酸生产车间[4]。木薯与其他作物相比，成本低、转化率高、适应性广。具体表现为：一方面，木薯能够利用少量的光、热、水等能源转化为高含量的淀粉；另一方面，木薯对各种恶劣环境抵抗力强，多数品种对大风、干旱、贫瘠、病虫等灾害都具有一定的抵抗力。

橡子是壳斗科（Fagaceae）植物果实的通称。壳斗科植物一般为落叶或常绿乔木，我国的橡子林共有 1.33×107～1.67×107hm2， 每年可产 60～70万吨橡子。

橡子淀粉是主要的橡子加工产品。橡子淀粉颗粒呈椭圆形，粒径较玉米淀粉、木薯淀粉小，糊化温度高于玉米淀粉和木薯淀粉，总体糊化特性与玉米淀粉相似。橡子淀粉具有广泛的用途，用于制备淀粉糖，转化率可达95%[5]。

葛根为豆科（Fabaceae）多年生缠绕藤本植物葛藤（Argyreia seguinii）的块根。葛根中含有优质淀粉、人体必需氨基酸（赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等）和微量元素（硒、锌、锰、锗等）。葛根淀粉具有糊化温度低、淀粉糊透明度高、黏度稳定性强等特点，目前葛根淀粉多应用于食品领域，尚未见应用于发酵工业的报道。

魔芋 （Amorphophalms konjac）是天南星科（Amceae）多年生草本植物。魔芋富含葡甘聚糖、淀粉、纤维素和维生素等，魔芋最主要成分是葡甘聚糖，其含量通常可高达70%，其次是淀粉。葡甘聚糖和淀粉都可作为氨基酸发酵的底物。我国是世界最大的魔芋生产国，主要加工产品为魔芋精粉，其下脚料魔芋飞粉占精粉质量的30%～40%，主要用作猪饲料。仅湖北省每年就有约8万吨魔芋飞粉未被利用，飞粉中90%是淀粉，通过微生物发酵可提高其附加值。

除了以上介绍的几种淀粉植物外，非粮淀粉质原料还有凉粉草、菊芋、芭蕉芋、薏苡、芡实、菱角、慈姑和荸荠等。

1.3 木质纤维素资源

其实无论是富含糖类的植物，还是淀粉类植物，都只是针对其特殊器官而言，从整株植物来说，都可以称为木质纤维素资源。生物质是指由光合作用产生的一切有机物的统称，包括植物、微生物以及食用植物、微生物的动物及其产生的废弃物。植物生物质绝大多数属于木质纤维素，包括农作物、杂草、木材、农林废弃物（秸秆、木屑等）、废纸张等。木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源，全球每年由光合作用产生的木质纤维素总量约为1000亿吨，其中碳水化合物占75%，随着社会需求和技术进步，终将会成为可发酵糖的主要来源。

1.3.1 木质纤维素组成

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，不同来源植物的化学组成受遗传和环境的影响，存在一定的变化。除了这3大类组分外，木质纤维素还包含其他结构聚合物，如蜡质、蛋白等。纤维素分子是由许多吡喃型的β-D-葡萄糖分子以β-1,4-糖苷键连接而成的长链高聚物，构成了木质纤维素的骨架结构。半纤维素提供了纤维素镶嵌的基质，也是由长链的多糖分子构成，除了己糖外，含有大量的戊糖。不同植物半纤维素糖类组成差异很大，主要由木葡聚糖、木聚糖、葡甘聚糖和甘露聚糖4种多聚物组成，水解后的单体有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等。木质素常与半纤维素、纤维素镶嵌在一起，不易分开。木质素一个基本的功能是提供机械支持作用，因此木本植物的木质素含量比草本植物要高。半纤维素和木质素可以共价结合在一起形成木质素糖类复合体（Lignin-carbohydrate complex），增加了纤维素的强度，并抵抗微生物对纤维素的降解。同时，纤维素、半纤维素、木质素与蛋白质、酸类等其他物质之间相互交联成致密的复杂结构。

1.3.2 木质纤维素预处理

木质纤维素复杂的网状结构天然具有抵抗微生物及酶降解的特性，因此，其糖化比淀粉要困难的多，在酶解之前必须要经过一定的预处理步骤。对于生物质预处理多采取试错的手段，缺乏系统的理论指导，也可能由于不同原材料、不同工艺的复杂性决定了预处理的多样性。目前该领域的研究和应用非常活跃，我们对各种预处理方法进行了比较分析，认为有发展潜力的有温热（Hydrothermal）预处理和化学（Chemical）预处理，以及由二者整合而成的热化学（Thermochemical）预处理。温热预处理主要包括蒸汽爆破预处理和水热预处理，化学预处理有稀酸、稀碱、有机溶剂和氧化预处理等。经过合适的预处理手段，木质纤维素3组分之间的交联结构部分解除，纤维素结晶结构遭到破坏，较大部分半纤维素发生降解，部分木质素被去除，不但减弱了木质纤维素对酶类的抗降解屏障，同时增加了酶分子与底物的可及性，使得用酶量减少，糖化得率增加。

1.3.3 木质纤维素酶解

木质纤维素结构的复杂性，决定了降解木质纤维素的酶类也复杂多样。纤维素酶是一类复杂酶系的总称，根据其催化功能可分为3大类：外切葡聚糖酶 （纤维素外切酶，也叫纤维二糖水解酶CBH）、内切葡聚糖酶（纤维素内切酶，简称EG）和β-葡萄糖苷酶（BGL）。半纤维素组分复杂多样，决定了半纤维素的酶解需要多种酶的协同作用。降解木聚糖主链的酶有木聚糖酶和β-木糖苷酶，木聚糖支链酶主要包括阿魏酸酯酶、葡萄糖醛酸酶、乙酰酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。同样，葡甘聚糖完全水解也需要聚甘露糖酶和β-甘露糖苷酶的协同作用。木质素酶主要包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

彻底降解结晶纤维素至少需要3类纤维素酶的协同作用：外切酶可以从纤维素链的还原端（CBH I）或非还原端（CBH II）开始持续水解纤维素结晶区，释放纤维二糖；内切酶主要作用于纤维素的非结晶区，随机水解纤维素链内的β-糖苷键，把纤维素长链切割为不同聚合度的短链，为外切酶作用提供更多的末端；β-葡萄糖苷酶主要水解纤维二糖和可溶性纤维寡糖，最终把纤维素转化为可利用的葡萄糖。近年来，由于纤维素乙醇项目的推动，纤维素酶的成本大幅降低，但仍占纤维素乙醇总成本的1/4左右。诺维信公司最新推出的第三代纤维素酶CellicRCTec3催化效率为第二代酶的1.5倍，水解玉米秸秆等木质纤维素产生1吨葡萄糖约需要28 kg酶量，获得每吨葡萄糖的总成本在3400～4500元之间。

2 原料替代需重视生物炼制

随着石化资源的不断消耗和环境问题的日益突出，使用绿色可再生的生物质原料进行“生物炼制”来生产各种产品，逐步代替现有的“石化炼制”已成为共识，为全世界长期坚持的发展目标。在此背景下，“绿色化工”、“绿色生产”、“绿色经济”、“循环经济”等概念应运而生。生物炼制最初的定义是指能够利用和加工生物质生产液体燃料、能源和化学品的设备装置和技术平台的组合，现在被普遍接受的概念是指将生物质转化为一系列产品的可持续加工过程，这些产品包括化学品、生物能源和生物材料。

为了发展非粮替代原料，氨基酸发酵工业需纳入到生物炼制的框架中来，以全局的理念来思考、系统工程的理论来指导。理由如下：首先，生物炼制的实现很大程度上依赖于发酵产业，氨基酸发酵是发酵工业的重要组成部分；其次，非粮原料本身的特性决定了处理工艺的复杂性和加工产品的多样性，野生植物资源和木质纤维素原料结构复杂，用现行的粮食加工工艺难以满足需求；第三，走生物炼制道路、对原料进行综合利用，是企业降低成本、减少污染的必由之路。

2.1 野生资源高附加值产品的提取

与粮食原料相比，野生植物资源淀粉含量较低，但往往包含一些具有其他重要价值的成分，若加以提取、开发高附加值产品，等同于降低企业的生产成本。反之，若走单一原料处理路线，可能会给加工和发酵过程带来困难，同时造成污染。下面将列举一些具体事例。

在木薯产业中，除淀粉外，木薯叶、木薯渣、木薯杆也是重要的资源，有待综合开发利用。如印度尼西亚的科研人员采用木薯皮制备表面活性碳，具体工艺是：先将木薯皮在氢氧化钾溶液中浸渍，接着在450～750°C的温度下碳化1～3 h[6]。另外，以木薯叶为原料加工的休闲食品也已问世。

橡子中含有较高浓度的单宁（4.55%），丹宁是重要的鞣质，广泛使用于印染行业。目前国内橡子淀粉生产多采用湿法，且大多仍采用传统工艺技术，所生产的橡子淀粉中单宁及其他杂质高，淀粉的产率和产量低，使得经济效益受到严重影响，而且用水量大，废水处理压力大，易造成环境污染。采用清洁工艺，可以同时从橡子壳（皮）中提取出丹宁和多羟基黄酮类色素物质，增加经济效益。另一方面，丹宁、黄酮类物质为典型的微生物发酵抑制物，若不提取，会对橡子淀粉糖的发酵产生抑制作用。

葛根、葛藤叶中含有12%异黄酮类化合物，主要包括：大豆苷元、大豆苷和葛根素。这些黄酮类化合物具有多种药理作用，能够降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管流量增加，明显缓解心绞痛，抗心律失常，抗氧化，增强机体的免疫力和降血糖。目前葛根黄酮类化合物作为药物和保健食品的应用越来越广泛。因此，在加工葛根淀粉的同时，提取高附加值的葛根黄酮非常必要。

魔芋中的葡甘聚糖具有束水性、胶凝性、增稠性、粘结性、可逆性、悬浮性、成膜性、赋味性等多种特性，因此在食品、医药、化工、纺织、印染、造纸、石油、地质等领域有着广泛的用途。魔芋葡甘聚糖的水溶胶在适当条件下成膜，可作为一种可食性和自然降解的膜材料，能在食品表面形成抗菌膜，起到保鲜防菌的作用。魔芋葡甘聚糖在生物工程上可制成胶质，用于电泳分离。

2.2 木质纤维素生物炼制

木质纤维素原料组分复杂、结构致密，寻找合适的预处理和组分分离手段是进行生物炼制的关键。我国是农业大国，农作物秸秆资源丰富，大量焚烧秸秆不但造成了环境污染，同时浪费了资源。为此，中国科学院过程工程研究所陈洪章研究员课题组在国家“973”计划“秸秆资源高值化关键过程的基础研究”的资助下，进行了系统深入的研究，建立了秸秆初级生物炼制平台。发明了常压无污染蒸汽爆破（汽爆）技术，特别适合孔隙度较大的秸秆类草本植物的处理。汽爆可分成两个阶段，首先是汽相蒸煮，高压蒸汽渗透到物料内的空隙，使半纤维素降解成可溶性糖，同时木质素软化和部分降解，降低与纤维素的连结强度；其次是爆破过程，利用汽相饱和蒸汽和高温液态水两种介质共同作用于物料，瞬间完成绝热膨胀过程，使物料在软化条件下产生剪切力发生变形运动。同时在汽爆过程中，半纤维素降解释放乙酸等有机酸，使物料发生自体催化作用。在以汽爆为基础的组分分离技术支撑下，陈洪章研究员团队实现了秸秆的多级分层综合利用，获得了乙醇、丁醇、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、瓦楞纸、聚醚多元醇、酚醛树脂等多种产品。于2010年在吉林省松原来禾化学有限公司建成 “30万吨/年秸秆炼制工业产业化生产线”，设计能力为年产丁醇、丙酮、乙醇5万吨，高纯度木质素3万吨，纤维素12万吨。目前该项目年处理秸秆500万吨，生产丁醇100万吨。

将木质纤维素水解为可发酵的单糖，可以通过“糖平台”路线作为氨基酸发酵的原料。然而也需要借鉴生物炼制的思路，不能为了获得可发酵糖分子，一味地加酶进行水解，既造成了浪费，也降低了效率。比较理想的路线是先用汽爆或稀酸预处理木质纤维素获得半纤维素水解液，再用碱萃取固形物获得木质素，最后加酶将纤维素水解为可发酵糖分子。在预处理过程中，大约有80%～90%的半纤维素降解成为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等可利用单糖，在去除半纤维素和木质素之后，纤维素由于没有其他分子缠绕，同时结晶结构也遭到一定程度的破坏，其酶解过程变得容易得多。大量研究证实，木质素会对纤维素酶产生无效吸附，去除之后可以降低用酶量，增加酶分子对纤维素的可及性。同时，木质素本身是十分重要的产品，可以用来加工高附加值的树脂、粘合剂和涂料等。

2.3 复杂培养基发酵产酶

以非粮原料制得的培养基成分比较复杂，含有多种碳源、氮源、微量元素、生长因子等，更加适合培养微生物菌体和产酶。木质纤维素水解液中，同时含有己糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖），多种糖类共存不利于快速发酵生产氨基酸，但有利于菌体积累和蛋白合成，同时由于葡萄糖浓度低，生成的副产物有机酸要少。氨基酸工业中，酶法合成占有重要的位置，如苯丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸都可以通过酶法生产。另外，一些特殊氨基酸（如非蛋白L-氨基酸、D-氨基酸、β-氨基酸）和氨基酸衍生物主要通过酶法合成。酮基丁酸、羟基丁酸、叔亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等需要通过酶法催化合成。拆分DL-氨基酸的重要的酶有氨基酰化酶和羧肽酶等，海因酶可以用于生产天然或非天然的α-或β-氨基酸，可以催化合成光学纯的L-或D-氨基酸，阿斯巴甜 （L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸甲酯）是由蛋白酶连接而成。总之，在发酵法生产蛋白氨基酸的同时，酶催化将成为非蛋白氨基酸和氨基酸衍生物生产的主要方式。今后可以开发多种非粮植物原料，用于培养微生物合成酶蛋白，满足酶法生产氨基酸的需求。

3 与原料替代相适应的菌株改造

通常，淀粉原料需经过糖化步骤被分解为葡萄糖，才能作为氨基酸发酵的底物。近年来，科学家们借鉴柠檬酸发酵的思路，尝试将淀粉酶转入到氨基酸发酵菌株中，直接以淀粉为底物进行发酵。木质纤维素水解液是一系列复杂糖类的组合，包括二糖单元的纤维二糖和乳糖，己糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖等）和戊糖。其中，除主要成分葡萄糖外，含有较高浓度的戊糖：5%～20%木糖和1%～5%阿拉伯糖。自然界的微生物以葡萄糖为最适底物，通常难以利用其他糖类。在生物乙醇项目推动下，以代谢工程手段改造酵母菌株扩大其可利用的碳源谱，已经进行了比较系统的研究。最近，也出现了一些对大宗氨基酸发酵菌株谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌相关代谢工程改造方面的报道。

3.1 直接利用淀粉

淀粉糖化步骤虽然高效，但需要高温蒸煮，能耗高，投入的液化酶和糖化酶用量大。通过微生物菌株改造，直接利用淀粉发酵可降低能耗和生产成本。Seibold等[7]在谷氨酸棒杆菌中构建重组质粒表达来源于灰色链霉菌 （Streptomyces griseus）的α-淀粉酶，使得菌株能够表达和分泌淀粉酶，以可溶性淀粉为底物合成赖氨酸。Tateno等[8]在谷氨酸棒杆菌基因组上整合表达异源α-淀粉酶，实现了直接利用粗淀粉高效发酵赖氨酸的生产工艺。 他们将牛链球菌（Streptococcus bovis）α-淀粉酶基因构建到几个基因的启动子及信号肽序列下，通过蛋白表达量的优化，最终选择将含有冷激蛋白CspB基因启动子的融合基因整合到谷氨酸棒杆菌基因组中，工程菌株以玉米淀粉或小麦淀粉为唯一碳源，发酵获得了5 g/L左右的赖氨酸产量。

3.2 直接利用纤维素

直接利用纤维素原料发酵生产氨基酸的技术难度很高，需要表达、分泌多种异源蛋白并协调其配比，同时兼顾蛋白合成和目标氨基酸合成的代谢途径。但是也有少量的相关研究报道。Paradis等[9]从粪产碱纤维单胞菌（Cellulomonas fimi）中克隆了外切葡聚糖酶Cex和内切葡聚糖酶CenA编码基因，构建了大肠杆菌和乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）穿梭质粒，实现了两个纤维素酶基因在这两种菌株中的表达。乳糖发酵短杆菌是氨基酸生产菌，可以发酵产生谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。采用相似的方法，Adham等[10]实现了霍耳斯特德氏链霉菌（Streptomyces halstedii）来源的木聚糖酶xysA和纤维素酶celA1编码基因在大肠杆菌和乳糖发酵短杆菌中的表达和分泌。2011年，Tsuchidate等[11]将热纤梭菌（Clostridium thermocellum）内切葡聚糖酶基因celA连接在大肠杆菌信号肽TorA下，在谷氨酸棒杆菌中表达；重组菌株在外源添加β-葡萄糖苷酶的条件下以15 g/L葡聚糖为底物进行发酵，获得了178 mg/L谷氨酸。受细菌纤维小体（Cellulosome）结构的启发，Hyeon等[12]在谷氨酸棒杆菌中构建了一个包含内切葡聚糖酶celE和脚手架蛋白CbpA的微型纤维小体，其催化羧甲基纤维素降解的效率是相应游离酶的2.8倍。其中，内切葡聚糖酶celE是由热纤梭菌celE的催化骨架和食纤维梭菌 （Clostridium cellulovorans）celB的对接结构域组成的嵌合蛋白，CbpA也来源于食纤维梭菌，这一结果为谷氨酸棒杆菌采用统合生物工艺（CBP）一步法发酵纤维素原料生产氨基酸奠定了基础。尽管取得了上述进展，但直接利用纤维素发酵氨基酸还有很长的路要走，短期内难以取得较大突破。

3.3 利用混合糖（戊糖利用）

同步利用己糖和戊糖，是木质纤维素水解液发酵工程中菌株改造的重要内容。木质纤维素水解液中的糖类主要包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。葡萄糖容易被多种微生物利用，而大多数微生物则难以利用木糖和阿拉伯糖。因此，戊糖代谢的菌种改造是氨基酸发酵领域中利用木质纤维素资源的关键问题。大肠杆菌本身可以利用木糖和阿拉伯糖，其代谢木糖的途径为：在木糖异构酶（Xylose isomerase）作用下，将木糖转化为木酮糖，然后在木酮糖激酶（Xylulokinase）作用下生成木酮糖-5-磷酸，进入磷酸戊糖途径。阿拉伯糖的代谢也是经过木酮糖-5-磷酸进入磷酸戊糖途径，然而它需要在3种酶：核酮糖激酶（Ribulosekinase）、阿拉伯糖异构酶（Arabinosei somerase）和核酮糖-5-磷酸差向异构酶 （Ribulose-5-phosphate-4-epimerase）的作用下才能被转化为木酮糖-5-磷酸[13]。谷氨酸棒杆菌是利用木质纤维素水解液极具潜力的菌种，它不但能够利用淀粉水解糖中的葡萄糖、糖蜜中的蔗糖和果糖，同时能够利用麦芽糖和核糖，以及水解液中的有机酸如乙酸、丙酸等。另外，谷氨酸棒杆菌对木质纤维素水解产生的一些常见发酵抑制剂糠醛类和酚类化合物具有抗性。然而，谷氨酸棒杆菌自身不能利用木糖和阿拉伯糖，需要采用基因工程手段引入大肠杆菌等微生物的戊糖代谢途径，才能发酵半纤维素水解产生的戊糖。2008年，Kawaguchi等[15]在谷氨酸棒杆菌中异源表达大肠杆菌的araA，araB和araD基因，重组菌株能够以阿拉伯糖为唯一碳源生长。当额外表达阿拉伯糖转运基因araE时，菌株利用阿拉伯糖的生长速率加快[16]。因为谷氨酸棒杆菌本身能够编码木酮糖激酶[17]，因此只要异源表达木糖异构酶基因xylA，就能实现以木糖为唯一碳源的生长[18]。然而，Meiswinkel等[19]同时表达了外源的木糖异构酶和木酮糖激酶基因，谷氨酸棒杆菌在木糖培养基上生长速率增加了一倍，该菌株还能利用稻草水解液生成少量谷氨酸和赖氨酸。

外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶水解纤维素的底物主要为纤维二糖，需要在β-葡萄糖苷酶的作用下才能被彻底水解为葡萄糖。现有商品化的纤维素酶主要来源于瑞氏木霉，β-葡萄糖苷酶含量较低，因此纤维素酶解产物中含有较高浓度的纤维二糖。2013年，Adachi等[20]在谷氨酸棒杆菌细胞表面过表达β-葡萄糖苷酶，重组菌株以纤维二糖为碳源生长，获得了与葡萄糖为底物相当的菌体浓度，在20 g/L纤维二糖培养基中发酵4 d，产生了1.08 g/L赖氨酸。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌被证实具有较弱的葡萄糖效应，能够同步利用多种糖类发酵。Gopinath等[21]在谷氨酸棒杆菌中异源表达大肠杆菌araBAD操纵子和木糖异构酶基因xylA，工程菌株在葡萄糖、木糖和阿拉伯糖复配的培养基中，或在稻草和麸皮水解液培养基中，同步代谢3种糖类产生谷氨酸和赖氨酸。Sasaki等[22]构建的能够代谢纤维二糖和木糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株，在葡萄糖存在的条件下也是同步利用3种碳源。

3.4 利用其他原料

乳清是奶制品工业的副产物，乳清中含有大量的乳糖，为氨基酸发酵工业潜在的重要原料。然而，谷氨酸棒杆菌自身没有代谢乳糖的酶类。Barrett等[23]在谷氨酸棒杆菌中异源表达德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）来源的乳糖代谢酶，包括乳糖透性酶和β-半乳糖苷酶，同时表达乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）来源的4种半乳糖代谢酶类，获得了能够利用乳清培养基的菌株，发酵赖氨酸产量可达2 g/L。

几丁质（Chitin）又称壳多糖，甲壳素，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，也存在于一些绿藻中，是自然界中储量仅次于纤维素的第二大天然多糖，每年能产生大约1亿吨。几丁质降解后的产物为N-乙酰葡萄糖胺和脱乙酰化的氨基葡萄糖（Glucosamine），既可作为发酵的碳源，同时也是氮源。通常，谷氨酸棒杆菌代谢氨基葡萄糖的速率缓慢。Uhde等[24]筛选到一株代谢氨基葡萄糖速率与葡萄糖相仿的谷氨酸棒杆菌，研究发现其nagB基因启动子区域发生了一个点突变，nagB编码6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶。氨基葡萄糖的代谢途径是首先在具通透酶活性的特异性磷酸葡萄糖转移酶系统 （PTS）作用下，跨膜转运的同时发生磷酸化生成6-磷酸葡萄糖胺，然后在脱氨酶作用下生成果糖-6-磷酸，进入糖酵解途径。由此可见，该点突变导致nagB的过量表达，从而使得菌株能够以氨基葡萄糖为底物迅速生长。因此，可以借鉴上述构建谷氨酸棒杆菌工程菌株，以几丁质降解物氨基葡萄糖为底物，发酵生产氨基酸产品。

4 结语

氨基酸发酵在整个发酵工业中占据重要的地位，随着氨基酸及其衍生物应用范围的不断扩大，氨基酸发酵工业呈现逐年递增的态势。目前氨基酸发酵主要以粮食为原料，对我国的粮食安全造成一定的威胁，因此拓展原料来源、寻求替代原料成为重要的课题。可作为发酵原料的植物资源有富含糖类植物、淀粉质植物和木质纤维素。现有的社会环境需求和技术条件下，利用上述替代原料发酵氨基酸成本较高。然而，企业如能因地制宜，就近取材，在生物炼制概念的指导下，对特色野生植物资源进行综合开发，发酵氨基酸的同时获得高附加值的产品，既能降低成本，又减少了污染，可能形成具有竞争力的产业结构，同时带动地方经济的发展。从长远来看，木质纤维素的利用为必然趋势，因为石化资源枯竭之后，纵然能够开发太阳能、风能、水能、地热能等多种替代能源，但人们日常生活中使用的材料的来源只有木质纤维素，只能通过生物炼制生产各种生物基材料。因此，政府应该制定相应政策，加大经费投入来鼓励木质纤维素资源利用的基础研究和产业开发。其中，通过代谢工程手段改造微生物菌株，同步利用木质纤维素水解液中的己糖和戊糖，发酵生产氨基酸产品，同时将本身难以降解又对绿色工艺造成影响的木质素提纯并加以利用，将是极具发展潜力的产业模式。另外，木质纤维素利用过程中原料的预处理、酶解以及发酵工艺是一个统一的整体，应该用系统学的概念前后对应、统筹兼顾，实现过程集成和绿色生产。我们相信，在政府、科研人员和企业的通力合作下，经过长期坚持和努力，氨基酸发酵工业将在以绿色、可再生生物质为原料的循环经济产业圈中扮演重要的角色。

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