肝癌干细胞的细胞分子标志物和信号通路的研究进展

郑 磊，张学彦，孔令建



综 述

肝癌干细胞的细胞分子标志物和信号通路的研究进展

郑 磊，张学彦，孔令建

癌,肝细胞；干细胞研究；信号传导

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第7种常见肿瘤，在我国位列肿瘤的第2位，仅次于肺癌，尤其在亚洲和非洲等受肝炎病毒影响严重的地区死亡率很高[1]。HCC的常规治疗方法有多种：如外科手术治疗、肝动脉插管栓塞化疗(TACE)、射频消融(RFA)和化疗药物治疗等，但各种方法都有其治疗的局限性[2]。目前，肝癌靶向治疗正在不断地取得进展，分离和鉴定特异性肝癌干细胞(liver cancer stem cells, LCSCs)的表面分子标志物，对探索肝癌的发病机制以及开展靶向治疗至关重要。由于LCSCs的特异性标记物还未被发现，只能根据LCSCs的干细胞所具有特异性的表面标志物来筛选其非特异性表面标志物。近来发现肝癌内部的一些信号转导通路的异常激活或抑制与肝癌的发生有着密切的联系。本文就肝癌相关的分子标志物和信号转导通路的研究进展作一综述。

1 肝癌干细胞分子标志物

目前，实验研究确定为肝癌干细胞分子标志物的有：CD133、乙醛脱氢酶、CD90、CD44、CD13、OV6、K19、c-kit、ABCG2、SALL4等。

1.1 CD133 CD133分子是一种5次跨膜糖蛋白，又被命名为prominin-1和AC133。研究发现，CD133(+)肝癌细胞具有明显的自我更新、分化和增值的能力，包括其分化成非肝细胞样谱系的能力和自我更新的能力[3]。采用免疫组化检测人肝癌手术标本，发现肝癌组织中频繁出现CD133(+)肿瘤细胞，高表达的CD133细胞占40%。有关临床资料分析显示，CD133的高表达更能体现出干细胞的自我更新、增殖的潜能与移植入免疫缺陷的小鼠后形成肿瘤的能力[4]。目前有实验研究发现肝癌细胞系Huh-7中CD133(+)细胞高表达，并且比CD133(-)细胞表现为体外更强的增殖潜能和更低的分化程度。研究还显示CD133(+)肝癌细胞成瘤能力与MAPK/PI3K信号通路的异常激活相关[5]。

1.2 乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH) ALDH主要存在于人体肝脏和肾脏细胞中，此类酶主要参与乙醇和乙醛的代谢。ALDH参与调节细胞的增殖，并在肿瘤干细胞中高表达，是一种新型的肿瘤干细胞标志物[6]。通过对ALDH和CD133相关的实验分析发现，ALDH的亚型表达与CD133表达呈正相关，不同的亚型表达与它们的致瘤能力密切相关，致瘤能力从高到低依次为：CD133(+)ALDH(+)>CD133(+)ALDH(-)>CD133(-)ALDH(-)，因此，联合检测这两种表面标记物对HCSCs致瘤性有着重要的意义[7]。最近实验表明，虽然CD133(+)ALDH(+)在肝癌细胞中致瘤性最高，但其在肝癌中所占的比率很低[8]。

1.3 CD90 CD90又称为Thy-1，是卵圆细胞的表面标志物。在裸鼠移植实验中发现，从人类肝癌细胞系分离出来的CD90(+)在免疫缺陷的小鼠体内可以成瘤，而CD90(-)无成瘤性[9]。最新研究发现，在肝癌标本中分离到了CD45(-)CD90(+)细胞，这些细胞在裸鼠体内显示出了致瘤特性，因此对CD45(-)CD90(+)这两种标志物的联合检测对肝癌诊断有一定的意义[10]。以上实验提示，CD90是一个较理想的LCSCs的候选标志物，将来可能发展成为新的治疗靶点。

1.4 CD44 CD44是由单基因编码的糖蛋白家族，目前作为实体肿瘤干细胞的重要标志物，它参与细胞与基质的粘连、组织重塑和细胞迁移。通过实验发现CD90(+)CD44(+)细胞恶性程度比CD90(+)CD44(-)细胞高，抑制CD44表达可阻止其种植瘤的形成[9]。实验证实CD133(+)CD44(+)细胞具有干细胞的特性。进一步研究表明CD133(+)CD44(+)肝癌细胞较CD133(+)、CD44(-)细胞呈现出更强的体内致瘤性[11]。因此对CD133(+)CD44(+)这两种标志物的联合检测对鉴定LCSCs有着积极的意义。

1.5 CD13 CD13又称氨肽酶N，早期被定义为髓样细胞表面标志物，它参与细胞的多个生物学过程，后经研究发现它是肝癌起源以及半数静止期HCSCs的标志物。实验通过对肝癌细胞系Huh7的侧群细胞进行分析，发现CD13高表达，而且CD13(+)主要存在于G1/G0期，治疗后，这些幸存的细胞通常在癌灶内形成细胞群[12]。随后的实验也发现，CD13(+)细胞致瘤能力较强，用化疗药物5-FU处理后，仍表现出显著的耐药性。实验通过使用CD13中和抗体下调CD13发现，可以成功地诱导肝癌细胞的凋亡[13]。以上实验说明，CD13通过其蛋白水解功能，干扰抗原呈递，逃避免疫识别，在肿瘤细胞的形成和发展中扮演重要的角色。

1.6 OV6 OV6是肝祖细胞的表面标志物。通过对218位OV6(+)的肝癌患者标本时发现，肝癌中OV6(+)患者预后不良，表现出侵袭性和致瘤性的升高，与其临床病理特征密切相关。OV6(+)的肝癌患者的总体生存率和无瘤生存率较低。进一步的实验发现OV6(+)细胞组会形成更多的微转移病灶，而OV6(-)组则未发现有转移，并且观察到了OV6(+)细胞存在于肺转移灶中，而且OV6(+)细胞与OV6(-)细胞比较表现出更强的体内成瘤性[14]。目前，作为HCSCs的表面标志物之一，关于OV6的研究较少，有待进一步的研究。

1.7 K19 K19是一种胆管型细胞角蛋白。研究人员采用微阵列研究方法对肝癌干细胞性相关蛋白表达进行研究，发现K19(+)常与CD133、EpCA等干细胞性相关蛋白联合出现，并表现出更强的致瘤性。K19(+)细胞与K19(-)细胞相比，与AFP的水平、肿瘤的恶性程度、血管的侵犯密切相关。此外，实验也证实，K19(+)表达的肝癌患者总生存期和无病生存期较短，而表达K19(-)的患者则体现不明显[15]。所以，联合检测K19(+)、CD133和EpCA对肝癌的诊断和治疗有着积极的意义。

1.8 c-kit c-kit又称干细胞因子受体(CD117)、肥大细胞因子受体，作为III型跨膜受体蛋白酪氨酸激酶受体的蛋白家族成员之一，与各类细胞的异常增殖有密切关系。有免疫组化研究已表明，c-kit广泛表达于HCC中，数量约在2.4%～80%[16]。也有报道称，c-kit高表达在肿瘤患者中体现出存活期长，预后较好[17]。由于c-kit受体与肝癌的发生、发展密不可分，目前，针对其的临床药物的有效性也表明，它也将成为肝癌治疗的潜在靶点。

1.9 ABCG2 ABCG2即三磷腺苷结合盒转运蛋白G2，在各种肿瘤细胞及正常组织干细胞中高表达，它也广泛表达于侧群细胞中，被认为是干细胞的通用标志物。有实验采用化疗药物作用和RNA干扰技术使ABCG2水平下降，表现为癌细胞增殖能力明显下降，说明ABCG2 可能通过主动外排抗肿瘤药物或其他机制来影响肿瘤的增值能力[18]。而ABCG2能否作为肝癌治疗的新靶点需要进一步的研究。

1.10 SALL4 SALL4是与果蝇基因同源的人类基因，包括SALL4A和SALL4B两个亚型，其可以编码锌指转录因子C2H2[19]。它在全能性胚胎干细胞自我更新维护中起关键性作用，并且与Nanog基因、Sox2和Oct4起相互作用[20-21]。最新研究显示，SALL4被认为是肝癌的一种亚型的标志物，与肝癌的预后不良有关[22]。

2 肝癌干细胞的相关信号通路

肝干细胞的自我更新和表型特征的多样化需要大量的信号来维持，这些信号包括Wnt /β-catenin信号通路、Hedgehog(Hh)信号通路、转化生长因子β、EpCAM和Notch信号通路，它们在干细胞的调节和肿瘤的形成中起着决定性作用。这些通路的异常激活可导致肿瘤的形成[23]。

2.1 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号通路是Wnt经典信号通路之一，目前研究的比较透彻。它由β-catenin基因、Wnt蛋白、Wnt蛋白配体frizzled蛋白、相关调控蛋白构成。Wnt/β-catenin信号通路是细胞的生长、发育、再生和自我更新的正常过程，它在进化上是保守的[24]。最新研究发现，在约85%的肝癌中可以检测到β-catenin的异常，其与Wnt/β-catenin信号通路异常活化有关[25]。

2.2 Hedgehog(Hh)信号通路 Hedgehog(Hh)信号通路控制细胞的增殖、分化和组织形成等过程，在肝癌的形成过程中起着调控的作用。Hh信号通路主要由核转录因子Gli以及下游目的基因、Hedgehog配体、2个跨膜蛋白受体Ptch和Smo组成。激活Hh信号通路时，Hh配体与Ptch受体结合,以自分泌或旁分泌的方式释放Smo，随后Smo进入细胞质，激活下游转录因子Gli，从而调控细胞生长、增殖和分化。此通路在成熟肝组织中无表达，而在肝癌中异常激活[26-27]。研究人员通过小分子抑制剂作用于靶点Gli基因，通过上调p27和下调c-myc、Bcl-2的表达，阻断Gli蛋白转录，对细胞周期进行调节，从而抑制肝癌细胞的生长[28]。

2.3 转化生长因子β 转化生长因子β(TGF-β)是一组调节细胞生长和分化的超家族分子(targeting the TGF-beta signaling pathway in disease)，它由结构相近、功能类似的多肽组成。在人体发育和生长过程中，TGF-β参与了原癌基因表达、伤口愈合、胚胎发育等阶段，它的异常表达与慢性肝炎、肝纤维化、酒精性肝病及肝癌等疾病有关[29]。在HCC中，TGF-β表现出抑制癌细胞增殖和增强癌细胞迁移黏附能力的双向调节作用，在HCC患者中发现，Smad3的磷酸化反应会因TβRⅡ的表达减少而抑制，由此表明了TGF-β信号通路的信号强度下调。实验结果表明，外源性TGF-β1刺激后，HCC细胞的生长受到TGF-β/Smads信号通路的抑制，然而敲除TβRⅡ后，自分泌型TGF-β不但对HCC细胞的生长没有表现出抑制，反而有利于其存活[30]。

2.4 EpCAM EpCAM又称为CD326，是一种新的肿瘤干细胞特征的表面标志物，它在正常成人肝脏组织中不表达，而在肝癌组织和肝干细胞中高表达，可通过促进细胞增殖、免疫逃逸等机制促进肿瘤的发生[31]。有研究发现，肝癌组织中的EpCAM(+)细胞具有自我更新、多向分化能力等干细胞特征，参与并引导肝癌细胞的生长和转移[32]。EpCAM也可通过Wnt信号通路活化细胞，使靶细胞转录和翻译，进而增殖，从而参与调控细胞周期。近年来更多研究发现EpCAM(+)细胞亚群更容易形成细胞群落，较EpCAM(-)细胞亚群具有更为显著的成瘤能力[33]。目前，EpCAM的作为肝癌的干细胞治疗潜在靶点的研究越来越多。

2.5 Notch信号通路 Notch信号通路虽然在进化过程中是高度保守的，但它也参与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移[34]。有研究证明，Notch信号诱导的肝癌细胞凋亡可能与蛋白磷酸激酶途径有关，诱导肝癌细胞周期可能会导致Notch1的停滞和凋亡，进而抑制肝癌细胞生长[35]。最新实验证明，下调Notch信号通路可以抑制肝癌细胞的生长，并且诱导其凋亡[36]。综上所述，肝癌细胞中存在Notch信号通路的失活，肿瘤的发生与Notch受体表达的异常有关，但是其在肝癌发生、发展及转移中的确切机制尚未明确，尤其是Notch信号通路在肝癌中起促癌作用还是抑癌作用尚有争议。因此，Notch信号通路对肝癌增殖的影响尚需进一步研究。

3 展望

目前，虽然研究人员已发现几种表面标志物可以用于分离、鉴定HCSCs，但是关于HCSCs标志物的研究还只局限于从正常肝干细胞的表面标志物去推定，因此，需要进一步的研究发现更多的、更特异的标志物来鉴定和分离HCSCs。HCC的发生、发展是一个多因素影响的复杂病理过程，已知多因子和多种信号通路共同参与其中，但是关于HCC发生的具体机制仍未明了，因此对其相关的多种信号通路的进一步研究显得尤为重要。今后，随着分子生物学的发展，对HCC的表面标志物和相关信号通路的研究越来越多，必将会发掘出更多潜在的HCC靶向治疗途径，为肝癌患者的治疗带来福音。

[1] Jemal A， Bray F， Center M M，etal. Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin， 2011，61(2):69-90.

[2] Lin S， Hoffmann K， Schemmer P. Treatment of hepatocellular carcinoma: a systematic review[J].Liver Cancer, 2012，1(3-4):144-158.

[3] Ma S， Chan K W， Hu L，etal. Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells[J].Gastroenterology， 2007，132(7):2542-2556.

[4] Song W， Li H， Tao K，etal. Expression and clinical significance of the stem cell marker CD133 in hepatocellular carcinoma[J].Int J Clin Pract， 2008，62(8):1212-1218.

[5] Huang H， Hu M， Li P，etal. Mir-152 inhibits cell proliferation and colony formation of CD133+ liver cancer stem cells by targeting KIT[J].Tumor Biol， 2014，61(8):181-189.

[6] Huang E H， Hynes M J， Zhang T，etal. Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis[J].Cancer Res， 2009，69(8):3382-3389.

[7] Ma S， Chan K W， Lee T K，etal. Aldehyde dehydrogenase discriminates the CD133 liver cancer stem cell populations[J].Mol Cancer Res， 2008，6(7):1146-1153.

[8] Lingala S， Cui Y Y， Chen X，etal. Immunohistochemical staining of cancer stem cell markers in hepatocellular carcinoma[J].Exp Mol Pathol， 2010，89(1):27-35.

[9] Yang Z F， Ho D W， Ng M N，etal. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer[J].Cancer cell， 2008，13(2):153-166.

[10]Bahnassy A A， Fawzy M， El-Wakil M，etal. Aberrant expression of cancer stem cell markers (CD44, CD90, and CD133) contributes to disease progression and reduced survival in hepatoblastoma patients: 4-year survival data[J].Transl Res， 2014，16(4):540-549.

[11]Zhu Z， Hao X， Yan M，etal. Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+ CD44+ population in hepatocellular carcinoma[J].Int J Cancer， 2010，126(9):2067-2078.

[12]Haraguchi N， Ishii H， Mimori K，etal. CD13 is a therapeutic target in human liver cancer stem cells[J].J Clin Invest， 2010，120(9):3326-3339.

[13]Kim H M， Haraguchi N， Ishii H，etal. Increased CD13 expression reduces reactive oxygen species, promoting survival of liver cancer stem cells via an epithelial-mesenchymal transition-like phenomenon[J].Ann Surg Oncol， 2012，19(3S):539-548.

[14]Yang W， Wang C， Lin Y，etal. OV6(+) tumor-initiating cells contribute to tumor progression and invasion in human hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol， 2012，57(3):613-620.

[15]Cogliati B， Aloia T P， Bosch R V，etal. Identification of hepatic stem/progenitor cells in canine hepatocellular and cholangiocellular carcinoma[J].Vet Comp Oncol， 2010，8(2):112-121.

[16]Lee E S， Han E M， Kim Y S，etal. Occurrence of c-kit+ Tumor Cells in Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma[J].Am J Clin Pathol， 2005，124(1):31-36.

[17]Chu H H, Cho B H, Song J S，etal. C-KIT-positive undifferentiated tumor of the liver: A case report[J].Oncol lett, 2014，8(4):1665-1669.

[18]Chen Z， Liu F， Ren Q，etal. Suppression of ABCG2 inhibits cancer cell proliferation[J].Int J Cancer， 2010，126(4):841-851.

[19]Al-Baradie R， Yamada K， St Hilaire C，etal. Duane radial ray syndrome (Okihiro syndrome) maps to 20q13 and results from mutations in SALL4, a new member of the SAL family[J].Am J Hum Genet， 2002，71(5):1195-1199.

[20]Melton C， Judson R L， Blelloch R. Opposing microRNA families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells[J].Nature， 2010，463(7281):621-626.

[21]Yang J， Gao C， Chai L，etal. A novel SALL4/OCT4 transcriptional feedback network for pluripotency of embryonic stem cells[J].PloS one， 2010，5(5):e10766.

[22]Jones B. Liver cancer: SALL4-a cancer marker and target[J].Nat Rev Clin Oncol， 2013，10(8):426.

[23]Cui J， Gong Z， Shen H M. The role of autophagy in liver cancer: molecular mechanisms and potential therapeutic targets[J].Biochim Biophys Acta， 2013，1836(1):15-26.

[24]Branda M， Wands J R. Signal transduction cascades and hepatitis B and C related hepatocellular carcinoma[J].Hepatology， 2006，43(5):891-902.

[25]Xu S， Tong M， Huang J，etal. TRIB2 inhibits Wnt/β-Catenin/TCF4 signaling through its associated ubiquitin E3 ligases, β-TrCP, COP1 and Smurf1, in liver cancer cells[J].FEBS Lett， 2014，588(23): 4334-4341.

[26]Arzumanyan A， Sambandam V， Clayton M M，etal. Hedgehog signaling blockade delays hepatocarcinogenesis induced by hepatitis B virus X protein[J].Cancer Res， 2012，72(22):5912-5920.

[27]Wang Y， Han C， Lu L，etal. Hedgehog signaling pathway regulates autophagy in human hepatocellular carcinoma cells[J].Hepatology， 2013，58(3):995-1010.

[28]Grzelak C A， Sigglekow N D， Watkins D N，etal. Reply to:"The many faces of Hedgehog signalling in the liver: Recent progress reveals striking cellular diversity and the importance of microenvironments"[J].J Hepatol， 2014，61(6):1451-1452.

[29]Dooley S， ten Dijke P. TGF-beta in progression of liver disease[J].Cell Tissue Res， 2012，347(1):245-256.

[30]Mu X， Lin S， Yang J，etal. TGF-beta signaling is often attenuated during hepatotumorigenesis, but is retained for the malignancy of hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One， 2013，8(5):e63436.

[31]Gonzalez L M， Montero E， Harrison L J，etal. Differential diagnosis of Taenia saginata and Taenia solium infection by PCR[J].J Clin Microbiol， 2000，38(2):737-744.

[32]Terris B， Cavard C， Perret C. EpCAM, a new marker for cancer stem cells in hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol， 2010，52(2):280-281.

[33]Guo W， Yang X R， Sun Y F，etal. Clinical Significance of EpCAM mRNA-Positive Circulating Tumor Cells in Hepatocellular Carcinoma by an Optimized Negative Enrichment and qRT-PCR-Based Platform[J].Clin Cancer Res， 2014，20(18):4794-4805.

[34]Geissler K， Zach O. Pathways involved in Drosophila and human cancer development: the Notch, Hedgehog, Wingless, Runt, and Trithorax pathway[J].Ann Hematol， 2012，91(5):645-669.

[35]Qi R， An H， Yu Y，etal. Notch1 signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma through induction of cell cycle arrest and apoptosis[J].Cancer Res， 2003，63(23):8323-8329.

[36]Greenhill C.Liver cancer: Different effects of the Notch receptors in liver cancer revealed[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2014，11(12):703.

国家自然基金资助项目(81370557)

150086哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科

张学彦，E-mail:zxycxw@sina.com

R730.261

A

2095-140X(2015)04-0099-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.04.026

2015-01-06 修回时间：2015-02-10)