mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

张文芳，潘春燕，张印星

mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

张文芳，潘春燕，张印星

目的探讨mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达水平及其相关临床诊断、治疗意义。方法

收集2012年1月—2014年1月手术切除或进行活检的正常宫颈组织65例，宫颈癌组织、癌旁组织各85例，提取组织中的mRNA，应用RT-PCR的方法来检测3种组织中mTOR和P70S6K mRNA的表达水平，并进行分析。结果 宫颈癌组织中mTOR、P70S6K mRNA的表达明显高于癌旁组织及正常组织(P＜0.05)，mTOR、P70S6K mRNA水平在宫颈癌组织、癌旁组织及正常组织中均呈正相关(P＜0.05)。结论 mTOR信号通路在宫颈癌组织中处于活化状态，其在宫颈癌的发生发展以及向其他部位转移中具有重要作用，是一个诊断和治疗的分子靶点。

宫颈肿瘤;TOR丝氨酸－苏氨酸激酶;核糖体蛋白质S6激酶类，70-kDa;他克莫司结合蛋白质类

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤发病率中占第2位，仅低于乳腺癌。据统计全世界每年宫颈癌的新发病例约50万例，并且每年有27万左右的妇女死于宫颈癌，死亡率在妇科恶性肿瘤中居于首位，85%以上的病例出现在发展中国家。中国每年宫颈癌的新发病例约14万，占全世界总数的三分之一以上［1］。随着医学科学技术的进步，宫颈癌在早期诊断、早期治疗等方面都取得了较大的进展，但是宫颈癌发生发展的机制目前仍不明确。阐明宫颈癌的分子生物学发病机制，获得宫颈癌分子生物学诊断、治疗的特异性标志物，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供新的作用靶点［2］，是目前研究的一个重要课题。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是由多个细胞信号介导的细胞信号通路，包括激素(胰岛素、生长激素)、营养素(氨基酸、葡萄糖)、细胞应激状态等，它是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR信号通路在正常机体内细胞的增殖和分化过程中具有重要的作用，目前还发现其在肿瘤的发生发展过程中具有作用，例如在乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤等组织中的表达出现异常［3］，而对于其在宫颈癌细胞和组织表达的研究较少。mTOR主要是通过其信号通路下的蛋白P70S6K发挥作用，P70S6K也是目前研究比较多的mTOR下游调节因子［4］，经过活化后可以激活核糖体40S小亚基蛋白，从而起到相应的分子生物学作用。本研究通过研究mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌组织中的表达，来初步探讨其在宫颈癌发生发展中的作用，为宫颈癌的早期诊断、早期预防和基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集2012年1月—2014年1月我院手术切除或进行活检的宫颈组织标本，其中正常宫颈组织65例，年龄 30 ～58(46．20 ±6．98)岁;宫颈癌组织、癌旁组织各85例，年龄28～60(43．8±7．12)岁;所有组织常规取材后，在离体30 min内储存在－80℃冰箱里，备用。

1.2 主要试剂 Trizol试剂盒、RT-PCR试剂盒和DNA标记物购自上海生工生物工程公司。引物依据mTOR和P70S6K的DNA序列进行设计，并由北京博大泰克生物技术公司设计合成。

表1 IL-18基因启动子-137G/C、-607C/A位点多态性引物

1.3 RT-PCR反应

1.3.1 RT反应体系:2μl、5×RT B缓冲液，1μl dNTP 混合液(10 mmol/L)，0．5 μl Oligo-dT，0．5 μl RNA 酶抑制剂(40 U/μl)，0．5 μl AMV 逆转录酶，5．0 μl样品 RNA，0．5 μl RNA free H2O。42℃、45 min;95℃、5 min;冰浴5 min，共35个循环。

1.3.2 PCR 反应循环条件:2．5 μl RT产物，0．5 μl Taq mix DNA polymerase，0．5 μl 上 游 引 物(5 μmol/L)，0．5 μl下游引物(5 μmol/L)，0．5 μl dNTP(10 mmol/L)，2．5 μl 10 × PCR Buffer，加ddH2O补充至总体积为 25．0μl。预变性温度94℃、3 min;变性温度 94℃、30 s;退火温度 60℃、30 s;延伸温度72℃、90 s;共35个循环;最后延伸温度 72℃、5 min。

1.3.3 PCR反应产物检测:用琼脂糖凝胶电泳将得到的PCR产物进行分离后，溴化乙啶进行染色，根据DNA标准条带确认扩增产物。凝胶成像分析仪扫描拍照，使用凝胶成像分析系统对条带进行光密度扫描分析测定条带灰度值。对比目的基因条带灰度值与内参基因电泳条带灰度值，计算目的基因的相对表达水平。

2 结果

2.1 宫颈癌组织、相应癌旁组织以及正常宫颈组织中mTOR mRNA的表达 宫颈癌组织、癌旁及正常宫颈组织中mTOR基因的扩增产物均有特异性条带显示，见图1。宫颈癌组织中mTOR mRNA的表达水平为 0．624±0．308，其明显高于癌旁组织(0.415 ±0．108)及正常组织(0．369 ±0．078)，差异均有统计学意义(P＜0.05);癌旁组织高于正常组织，但差异无统计学意义(P=0.064)。

图1 3组宫颈组织中m TOR mRNA的表达

2.2 P70S6K mRNA在宫颈癌组织、癌旁组织以及正常宫颈组织中的表达情况 宫颈癌组织、癌旁及正常宫颈组织的PCR扩增产物均显示特异性条带，如图2。P70S6K mRNA在宫颈癌组织中的表达水平(0．598 ±0．256)明显高于癌旁组织(0．468 ±0.154)及正常组织(0．408 ±0．112)，差异有统计学意义(P＜0.05);癌旁组织高于正常组织，但差异无统计学意义(P=0.090)。

图2 3组宫颈组织中P70S6K mRNA的表达

2.3 宫颈癌组织、癌旁组织以及正常宫颈组织中mTOR、P70S6K mRNA表达的相关性 mTOR、P70S6K mRNA水平在宫颈癌组织、癌旁组织及正常组织中均呈正相关(P＜0.05)，见表2。

表2 3组宫颈组织中m TOR、P70S6K m RNA表达的相关性(±s)

表2 3组宫颈组织中m TOR、P70S6K m RNA表达的相关性(±s)

组别 例 mTORmRNA P70S6KmRNA r P宫颈癌组织85 0．624 ±0．308 0．598 ±0．256 0．569 0．013癌旁组织 85 0．415 ±0．108 0．468 ±0．154 0．611 0．005正常宫颈组织65 0．369 ±0．078 0．408 ±0．112 0．745 0．014

3 讨论

近年研究表明人乳头瘤状病毒感染是导致宫颈癌发生的一个重要因素。但多数感染人乳头瘤状病毒的患者最终并不会发展成宫颈癌［5］。随着人们对恶性肿瘤发生发展的分子生物学的深入研究，发现调控细胞生长的一些信号通路在肿瘤发生过程中具有非常重要的作用，所以信号通路、细胞因子渐渐成为人们进行诊断、治疗肿瘤的靶点，如VEGFa、TP53、PIK3CA、MEK/ERK、mTOR/P70S6K 等多个信号通路，mTOR/P70S6K信号通路就是其中之一［6-13］，这些通路中的信号传导均与mTOR/P70S6K的表达有一定的关系，因此，mTOR/P70S6K信号通路在宫颈癌的发生和发展过程中的作用非常重要。

mTOR是在分析不同啤酒酵母突变体对雷帕霉素抵抗作用的差别时发现的。其广泛存在于各种细胞中［14-16］，是一类保守的大分子蛋白质，mTOR信号通路在正常细胞和肿瘤细胞的生长、分化的过程中具有较为重要的作用。这个信号通路的活化会抑制细胞凋亡，并且促进细胞的存活和增殖。它与正常细胞的癌变、癌细胞的生存、增殖具有紧密的关系，其在肿瘤的发生和发展过程中发挥着不可替代的作用［17-18］。Rashmi等［19-20］研究表明，通过阻断 mTOR信号通路可以调节PI3K/AKT信号通路，进而促进宫颈癌细胞的凋亡，PI3K/AKT信号通路在各种肿瘤组织中均有突变，影响肿瘤细胞放化疗后的治疗效果及预后。

本研究表明，宫颈癌组织中mTOR mRNA的表达水平明显高于癌旁组织及正常宫颈组织，同时，宫颈癌组织中P70S6K mRNA的表达水平也明显高于癌旁及正常宫颈组织。宫颈癌组织中P70S6K mRNA、P70S6K mRNA的表达水平与癌旁组织及正常宫颈组织比较，均具有明显统计学差异。mTOR mRNA、P70S6K mRNA在宫颈癌组织、癌旁组织、正常宫颈组织中的表达均呈正相关，组织中mTOR mRNA的表达水平越高，相应的P70S6K mRNA表达水平也越高。这也证实了P70S6K是mTOR信号通路中下游的一个比较重要的作用靶点，其活化后，能够使P70S6K磷酸化，进而发挥其调控与各种生理生化活动相关蛋白质的合成，最终达到细胞的生长和增殖。

综上所述，mTOR信号通路在宫颈癌组织中处于活化状态，其在宫颈癌的发生发展过程中，宫颈癌向其他部位转移的过程中具有重要的作用。同时其也是具有非常好的诊断和治疗前景的靶点，为宫颈癌的早期诊断、基因治疗等提供了一定的基础。

［1］ 朱旭明，王鲁文，董延华，等．4EBP1和P70S6K在不同宫颈病变组织中的表达及其意义［J］．中国妇幼保健，2013，28(12):1959-1962．

［2］ Kang S，Dong SM，Kim B R，et al．Thioridazine induces apoptosis by targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in cervical and endometrial cancer cells［J］．Apoptosis，2012，17(9):989-997．

［3］ Hou L L，Gao C，Chen L，et al．Essential role of autophagy in fucoxanthin-induced cytotoxicity to human epithelial cervical cancer HeLa cells［J］．Acta Pharmacol Sin，2013，34(11):1403-1410．

［4］ 陈天敏，方小玲．mTOR在子宫肌瘤中表达的研究［J］．中国现代医学杂志，2013，23(30):47-51．

［5］ Li S，Li Y，Hu R，et al．ThemTOR inhibitor AZD8055 inhibits proliferation and glycolysis in cervical cancer cells［J］．Oncol Lett，2013，5(2):717-721．

［6］ Garcia-Maceira P，Mateo J．Silibinin inhibits hypoxia-inducible factor-1alpha and mTOR/p70S6K/4E-BP1 signalling pathway in human cervical and hepatoma cancer cells:implications for anticancer therapy［J］．Oncogene，2009，28(3):313-324．

［7］ Chen B，Zhang C，Dong P，etal．Molecular regulation of cervical cancer growth and invasion by VEGFa［J］．Tumour Biol，2014，35(11):11587-11593．

［8］ Tornesello M，Annunziata C，Buonaguro L，et al．TP53 and PIK3CA gene mutations in adenocarcinoma，squamous cell carcinoma and high-grade intraepithelial neoplasia of the cervix［J］．JTransl Med，2014，12(1):255．

［9］ Hou M M，Liu X，Wheler J，etal．Targeted PI3K/AKT/mTOR therapy formetastatic carcinomas of the cervix:A phase I clinical experience［J］．Oncotarget，2014，5(22):11168-11179．

［10］ Roy B，Pattanaik A K，Das J，et al．Role of PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK pathway in Concanavalin A in-duced autophagy in HeLa cells［J］．Chem Biol Interact，2014，210:96-102．

［11］ Husseinzadeh N，Husseinzadeh H D．mTOR inhibitors and their clinical application in cervical，endometrial and ovarian cancers:a critical review［J］．Gynecol Oncol，2014，133(2):375-381．

［12］Wan G，Xie W，Liu Z，et al．Hypoxia-induced MIR155 is a potentautophagy inducer by targetingmultiple players in the MTOR pathway［J］．Autophagy，2014，10(1):70-79．

［13］ Roche E，Lascombe I，Bittard H，et al．The PPARβ agonist L-165041 promotes VEGF mRNA stabilization in HPV18-harboring HeLa cells through a receptor-independentmechanism［J］．Cell Signal，2014，26(2):433-443．

［14］陈业刚，杨拓，刘鹏．p-mTOR、p-p70S6K蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达［J］．中国中西医结合外科杂志，2013，19(6):639-642．

［15］ Chi E Y，Viriyapak B，Kwack H S，et al．Regulation of paclitaxel-induced programmed cell death by autophagic induction:A model for cervical cancer［J］．Obstet Gynecol Sci，2013，56(2):84-92．

［16］ Wan G，Xie W，Liu Z，et al．Hypoxia-induced MIR155 is a potentautophagy inducer by targetingmultiple players in the MTOR pathway［J］．Autophagy，2014，10(1):70-79．

［17］肖若冰，肖雅莉，陈云锋，等．原发性胆囊癌组织中mTOR/p70S6K信号通路的表达及其临床病理学意义［J］．江西医药，2009，44(3):214-216．

［18］ Xu Q J，Hou L L，Hu GQ，etal．Molecularmechanism of ophiopogonin B induced cellular autophagy of human cervical cancer HeLa cells［J］．Yao Xue Xue Bao，2013，48(6):855-859．

［19］ Rashmi R，DeSelm C，Helms C，et al．AKT inhibitors promote cell death in cervical cancer through disruption of mTOR signaling and glucose uptake［J］．PLoS One，2014，9(4):e92948．

［20］ Shin JM，Jeong Y J，Cho H J，etal．Melittin suppresses HIF-1alpha/VEGF expression through inhibition of ERK and mTOR/p70S6K pathway in human cervical carcinoma cells［J］．PLoSOne，2013，8(7):e69380．

Expression ofmTOR/P70S6K Signaling Pathway in Human Tissues of Cervical Cancer and Its Clinical Significance

ZHANGWen-fang，PAN Chun-yan，ZHANG Yin-xing(Department of Obstetrics and Gynecology，Central Hospital of Huangshi City，Huangshi，Hubei435000，China)

ObjectiveTo analyze the expression ofmTOR/P70S6K signaling pathway in human tissues of cervical cancer and its clinical significance．MethodsA total of65 normal cases of cervical tissues(group A)，85 cases of cervical cancer tissues(group B)and 85 casesof para-carcinoma tissues(group C)from patientsundergoing exairesisor biopsy during January 2012 and January 2014 were collected，and thenmRNA wasobtained from all the groups．ThemRNA expressions ofmTOR and P70S6K in the three groupswere detected using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)method，and then the expressions were analyzed．ResultsThe mRNA expressions of mTOR and P70S6K in group C were significantly higher than those in group A and B(P＜0.05)，and themRNA expressions of mTOR and P70S6K had significantly positive correlations in the three groups(P＜0.05)．ConclusionThemTOR signaling pathway is in an activated state in human tissues of cervical cancer，and plays an important role in the pathogenesis，development and metastasis，therefore itmay be used as a therapeutic target．

Uterine cervical neoplasms;TOR serine-threonine kinases;Ribosomal protein S6 kinases，70-kDa;Tacrolimus binding proteins

R737．33

A

2095-140X(2015)04-0012-04

10．3969/j．issn．2095-140X．2015．04．004

435000湖北黄石，黄石市中心医院妇产科

2014-12-17 修回时间:2015-01-16)

·小经验·