新疆维吾尔族老年人低骨量与ADPN基因多态性的相关性研究

乔剑楠，周晓辉

(新疆医科大学第一附属医院干部病房内一科，新疆 乌鲁木齐 830054)

新疆维吾尔族老年人低骨量与ADPN基因多态性的相关性研究

乔剑楠，周晓辉

(新疆医科大学第一附属医院干部病房内一科，新疆 乌鲁木齐 830054)

目的 研究ADPN基因2个单核苷酸多态性位点T45G(rs2241766)、G276T(rs1501299)与新疆维吾尔族老年人低骨量的相关性，探讨该基因多态性维吾尔族的分布差异。方法收集2010年以来入住新疆医科大学第一附属医院干部病房的维吾尔族患者共490例，使用双能X线骨密度仪测量腰椎或髋关节骨密度（BMD）值，根据BMD值进行分组，其中低骨量病例组(骨量减低组+骨质疏松组)250例，对照组(骨量正常组)240例。采用多重SNaPshot SNP方法对ADPN基因T45G及G276T位点进行基因分型。结果(1)ADPN基因多态性在病例组与对照组间整体进行比较，基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P＞0.05)；(2)ADPN基因T45G、G276T两位点按性别分组，该基因多态性在男性、女性之间的分布差异无统计学意义(P＞0.05)；(3)Logistic回归分析提示女性及高血压是影响骨质疏松的独立危险因素。结论ADPN基因T45G、G276T多态性与新疆地区维吾尔族老年人群低骨量发生无明显相关性。

ADPN基因；低骨量；骨密度；维吾尔族

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加和骨折为特征的一种全身性骨病[1]。它是一种患病风险随年龄增长而逐渐增加的退行性疾病，已成为人类健康的重要杀手。脂联素(ADPN)是近年新发现的一种由脂肪细胞特异分泌的细胞因子，在调节糖和脂肪代谢、抗炎、抗动脉粥样硬化等过程发挥重要作用[2-3]。

脂联素基因位于染色体3q27，是代谢综合征的易感位点，其基因全长16 kb，由3个外显子和2个内含子组成，编码244个氨基酸。体外研究和动物实验均表明脂联素可通过抑制破骨细胞的骨吸收活性，增加成骨细胞的活性和骨基质的矿化，增加骨量[4]。

本研究拟探讨新疆维吾尔族老年人的ADPN基因多态性与低骨量的关系及分布差异，为该人群骨质疏松的遗传学机制研究提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年3月至2014年6月以来连续收集入住新疆医科大学第一附属医院干部病房住院的维吾尔族老年患者490例，根据BMD测定结果进行分组。病例组250例(骨量减低168例+骨质疏松82例)，年龄平均(71.290±7.430)岁；对照组240例，年龄60～88岁，平均(69.894±6.789)岁。

1.2 纳入标准 严格参照2011年世界卫生组织(WHO)推荐的最新OP诊断标准[1]，根据DEXA测定结果：以骨量正常(T＞-1)为对照组，将骨量减低患者(-2＜T≤-1)和骨质疏松患者(T≤-2)合称为低骨量病例组(T≤-1)。意识清楚，语言表达能力正常，年龄≥60岁，长期居住新疆达10年以上；遵循自愿原则，并与患者签订知情同意书。

1.3 排除标准 (1)影响骨代谢性疾病(如甲状腺疾病、甲状旁腺疾病、严重肝肾功能疾病及免疫性疾病等)；(2)长期服用促骨形成及抑制骨形成制剂、激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂等影响骨代谢的药物；(3)恶性肿瘤，如恶性淋巴瘤、肺癌、多发性骨髓瘤、胃癌、白血病等；(4)骨折、手术史等。

1.4 方法

1.4.1 调查内容 研究对象均接受了流行病学问卷调查，问卷调查内容包括：(1)一般社会人口学资料；(2)个人生活习惯；(3)家族史及既往疾病史；(4)疾病诊断及服药情况；(5)骨质疏松的风险评估。

1.4.2 骨密度测定 利用法国DMS公司生产的DEXA骨密度检测腰椎前后位和(或)髋关节BMD，开机后用体模对设备进行BMD校准。当体模测量值的变异系数(腰椎为1.2%，股骨近端为2.0%)在正常范围内时即可开始检测，每部位重复操作3次，每次均重新定位。骨密度检测人员是经过专门培训的同一个技术人员，骨密度分析系统可自动获得BMD结果。

1.4.3 基因组DNA提取 采集空腹外周静脉全血2 ml于EDTA抗凝管中，1 h内储存在备用的-80℃冰箱中。使用DNA快速提取试剂盒提取静脉全血基因组DNA，其方法按照DNA提取试剂盒操作规程说明进行。然后根据估计的浓度将样本稀释至工作浓度5～10 ng/μl。

1.4.4 引物设计 设计用于扩增本研究中所要求SNP位点片段的PCR引物，及相邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。用Primer3.0软件设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。

表1 引物序列

1.4.5 PCR反应 ADPN基因T45G、G276T多态进行所在片段的PCR扩增反应，经3 U SAP酶和1 U Exonuclease I酶纯化后，得到纯化的PCR产物。再进行SNaPshot单碱基延伸纯化反应，最后获得纯化的延伸产物。

1.4.6 基因测序 取0.5 μl纯化后的延伸产物，与0.5 μl Liz120 SIZESTANDARD，9 μl Hi-Di(美国ABI)混匀，95ºC变性5 min后上ABI3730XL测序仪，在该测序仪上收集原始数据，并用GeneMapper 4.1来分析进行基因测序。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计处理，利用检验判断等位基因及各基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用均数±标准差(±s)对计量资料进行描述，数据进行正态性检验和方差齐性检验后，符合正态性和方差齐者，其两组间比较采用t检验；不符合正态性分布及方差不齐者，其两组间比较采用秩和检验。采用χ2检验或Fisher精确概率法对计数资料进行比较；建立Logistic回归模型对相关因素进行分析，所有统计检验均为双侧概率检验，以P＜0.05(双尾)作为检验水准。

2 结果

2.1 低骨量病例组与对照组的一般资料比较 两组老年患者的性别、年龄、体重指数、甘油三酯、胆固醇、高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等指标比较显示，除了性别和高血压比较差异有统计学意义(P＜0.05)外，其余各项指标比较差异均无统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.2 基因测序结果 基因测序后上ABI3730XL测序仪，在该测序仪上收集原始数据，并用GeneMapper 4.1来分析进行基因测序，见图1～图3，峰值右侧方标示代表其基因型，单峰表示纯合，双峰表示杂合。

表2 两组老年患者的一般资料比较[例(%)，±s]

表2 两组老年患者的一般资料比较[例(%)，±s]

组别病例组对照组χ2/t值P值性别(男性) 115(46.0) 168(70.0) 18.612 0.000冠心病114(45.6) 102(42.5) 0.582 0.649高血压190(76.0) 126(52.5) 17.770 0.000糖尿病116(46.4) 132(55.0) 0.036 0.319年龄(岁) 71.290±7.430 69.894±6.789 1.032 0.079 BMI(kg/m2) 24.462±2.592 23.692±3.256 -0.343 0.663甘油三酯(mmol/L) 1.907±1.576 1.993±3.276 -0.369 0.725胆固醇(mmol/L) 4.562±1.138 4.378±1.333 1.323 0.195

图1 ADPN基因T45G、G276T位点野生纯合型

图2 ADPN基因T45G、G276T位点突变杂合型

图3 ADPN基因T45G、G276T位点突变杂合型

2.3 ADPN基因T45G、G276T多态性在两组维吾尔族老年人群低骨量的分布频率比较 T45G、G276T基因型及等位基因频率在病例组与对照组间整体进行比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；在病例组中与对照组中分别进行维吾尔族的比较，ADPN基因T45G、G276T多态性中各基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3和表4。

2.4 两组不同性别维吾尔族老年人ADPN基因T45G、G276T多态性的比较 由于性别在一般资料中存在差异，为进一步明确维吾尔族中性别与ADPN基因多态性是否存在一定的相关性，故将ADPN基因多态性与性别之间进行了相关分析。由表5、表6可见，ADPN基因T45G、G276T两位点各基因型及等位基因频率在男、女性别之间的分布差异无统计学意义(P＞0.05)，且在同性别的病例组与对照组之间，及同组别的男、女性别之间的差异比较也均无统计学意义(P＞0.05)。

表3 两组维吾尔族老年人ADPN基因T45G多态性的分布[频数（%）]

表4 两组维吾尔族老年人ADPN基因G276T多态性的分布[频数（%）]

表5 不同性别的维吾尔族老年人ADPN基因T45G多态性的分布[频数(%)]

表6 不同性别的维吾尔族老年人ADPN基因G276T多态性的分布[频数(%)]

2.5 新疆维吾尔族老年人低骨量相关因素的非条件Logistic回归分析 由表2一般资料比较可见，在病例组及对照组之间分布存在差异，为进一步明确民族、性别、高血压病、身高与ADPN基因位点T45G、G276T多态性等因素与低骨量之间的关系，本研究将上述因素共同纳入Logistic回归分析中(表7)。从表7可见，性别、高血压病是独立危险因素。民族、身高及ADPN基因位点T45G、G276T多态性与低骨量发生无明显相关性(P＞0.05)。

表7 维吾尔族老年人低骨量相关因素的非条件Logistic回归分析

3 讨论

新疆是中国多民族聚居突出的地区之一，本研究通过维吾尔族老年人群基因多态性，对于探索骨质疏松症致病基因和易感基因的分布特征、研究骨质疏松症的发病机理及基因水平的诊断和治疗有重要意义。脂联素具有抗动脉粥样硬化、调节血糖和抗炎等作用[3]。

脂联素可以从以下途径影响骨代谢[5]：骨骼局部产生的脂联素以自分泌或旁分泌的途径促进骨形成，而循环中的脂联素则以内分泌的途径抑制骨形成，另外，脂联素通过影响胰岛素信号通路间接促进骨的形成，对骨代谢的作用是上述三者综合作用的结果。Sodi等[6]发现高分子量多聚体脂联素/总脂联素比率与护骨素呈负相关，表明脂联素能影响骨代谢是通过改变成骨细胞产生护骨素从而影响破骨细胞调控的骨吸收。张向梅等[7]认为脂联素可通过抑制护骨素表达、诱导成骨细胞RANKL表达，诱导破骨细胞生成。临床研究方面，一些学者认为脂联素与骨密度呈负相关，而另一些研究者却末能找到脂联素与骨密度相关的证据[7]。

3.1 ADPN水平与骨密度关系 Frost等[8]和Barbour等[9]发现20～29岁的健康男性脂联素与峰值骨量、髋部BMD负相关，与股骨颈骨髓腔大小正相关。来自美国的报道：年龄70～79岁的健康老人，只有女性髋部和全身骨密度每年丢失率与脂联素有关，而男性无关，然而同一组人群男性而不是女性血清脂联素水平越高，骨折风险越大，这种关系独立于身体组分和骨密度。Johansson等[10]发现老年男性，脂联素独立于骨折其他危险因素，可以预测骨折风险，推断脂联素水平的高低有可能是骨折的一个危险因素。最近的META分析显示脂联素与BMD负相关突出明显，然而只有在男性高水平脂联素可以预测脊柱骨折的风险。最新报道高水平血清脂联素可以预测老年男性骨折风险。也有相反的报道，意大利的研究年龄在29～97岁的男性，脂联素与BMD无明显相关性。

3.2 ADPN单核苷酸多态性与骨密度的关系 甘洁民等[11]发现上海地区绝经后妇女脂联素基因单核苷酸多态性与骨质疏松症无相关性，与骨转换率也无相关性。Lee等[12]对韩国249例女性和80例男性进行脂联素基因第2外显子T45G和第2内含子G276T多态性与骨密度关系分析，发现韩国妇女携带T45G位点的G等位基因的个体的腰椎骨密度比那些携带TT基因型的低，而男性T45G各组基因型的骨密度则差异无统计学意义。因此，T45G(rs2241766)、G276T(rs1501299)的基因型可能与骨量或者骨形成有关。本实验结果显示，校正年龄、体质量、身高及体质指数之后，ADPN基因T45G、G276T两位点分析显示，2个位点均存在多态性；但与老年维吾尔族人群骨密度无明显相关性。可能是该多态位点与疾病位点存在连锁不平衡所致。同一基因多态性在更大的人群中是否表现出同样的结果还需要深入研究。实验结果还提示T45G(rs2241766)、G276T(rs1501299)多态性并没起重要的病因学作用，或者位点通过与其他位点相互作用、相互影响而协同致病，而其本身没有起主因子的作用，故与骨密度无相关性。

3.3 低骨量与高血压病、女性的关系 女性一生中受骨量的影响因素主要与体内雌激素水平有关。邢晨芳等[13]将153例女性分为绝经组及未绝经组进行比较研究发现，前者的骨密度较后者严重偏低。表明女性骨量下降主要受体内雌激素水平的控制。导致破骨细胞活性相对增强，成骨细胞活性绝对降低，从而引起骨吸收增加及骨形成减少，血液中钙离子明显增加，由于负反馈作用抑制体内甲状旁腺激素的分泌，维生素D合成也减少，进一步引起钙离子在胃肠道内的吸收减少，加速骨量丢失。

目前关于高血压病导致骨量减少的机制研究尚不成熟，主要考虑有以下几方面：(1)肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS)可使血管收缩从而升高血压，同时血管紧张素Ⅱ也可激活破骨细胞前体分化成熟，诱导该类细胞中核因子配合体受体激动剂的表达，使破骨细胞活动增强，从而导致骨量减少；(2)维生素D缺乏可间接激活RASS，从而引起血压升高，同时可激活甲状旁腺激素，减少钙离子的吸收，导致骨量减低；(3)体内钙随尿液排除增多可引起血清钙离子水平降低，机体为升高血钙通过负反馈作用引起甲状旁腺功能亢进，进而促进肠钙吸收，破骨细胞活性相对增强，进而出现血钙和软组织钙含量增加而骨钙减少的“迁徙”现象，引起骨代谢失衡，出现OP。

综上所述，本研究未发现ADPN基因T45G、G276T两位点多态性在维吾尔族分布存在差异，可能ADPN基因T45G、G276T多态性与新疆地区维吾尔族老年人群低骨量发生无明显相关性。女性、高血压病是低骨量发生的独立危险因素。故这两个位点多态性可能不是本研究维吾尔族老年人群纳入对象低骨量发生的危险因子。

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Correlation of polymorphisms of ADPN gene with low bone mineral density in elderly Uyghur people in Xinjiang province.

QIAO Jian-nan,ZHOU Xiao-hui.The First Department of Internal Medicine,Cadre Wards,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo study the correlation of polymorphisms of ADPN gene T45G(rs2241766)and G276T(rs1501299)with low bone mineral density in elderly Uyghur people in Xinjiang province,and to explore the distribution differences of polymorphisms of the gene in ethnic people.MethodsA total of 490 elderly Uyghur patients were selected from cadre wards of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University since 2010.Dual energy X-ray absorptiometry was used to detect bone mineral density(BMD)of lumbar spine and hip.All the patients were divided into the low BMD case group(with osteopenia and osteoporosis,250 cases)and control group(normal BMD,240 cases)according to the value of BMD.Genotype of ADPN T45G and G276T polymorphisms were done by multiplex SNaPshot reaction.Results(1)ADPN gene polymorphisms were compared between the low BMD case group and control group,which showed that there was no significant difference in the distribution of genotypes and alleles(P＞0.05).(2)The polymorphism of ADPN gene(T45G,G276T)showed no statistically significant difference in the distribution between male and female(P＞0.05);(3)Logistic regression analysis showed that women and hypertension were the independent risk factors for low osteoporosis.ConclusionADPN gene(T45G,G276T)polymorphism showes no significant correlation with low bone mineral density in elderly Uyghur people in Xinjiang province.

ADPN gene;Osteopenia;Bone mineral density;Uyghur

R68

A

1003—6350（2015）10—1418—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0508

2014-10-19)

乔剑楠。E-mail：358838581@qq.com