miR-200a和miR-155在狼疮性肾炎患者肾组织中的表达及其作用机制探讨

潘妩姗，何永成，陈洪滔

（1.广州医科大学研究生院，广东 广州 510182；2.深圳市第二人民医院肾内科，广东 深圳 518035）

miR-200a和miR-155在狼疮性肾炎患者肾组织中的表达及其作用机制探讨

潘妩姗1，何永成2，陈洪滔2

（1.广州医科大学研究生院，广东 广州 510182；2.深圳市第二人民医院肾内科，广东 深圳 518035）

目的 探讨miR-200a及miR-155在狼疮性肾炎(LN)患者肾组织中的表达及其在LN发病机制中的作用。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应测定30例LN患者和15例健康对照组肾组织中miR-200a及miR-155的表达水平。结果LN患者肾组织中miR-155的表达水平高于健康对照组，miR-200a的表达水平低于健康对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。LN患者肾组织中miR-200a的表达水平与狼疮评分呈负相关(r=-0.391，P=0.032)，miR-200a的表达水平与尿蛋白呈负相关(r=-0.395，P=0.034)。miR-155与狼疮评分呈正相关(r=0.593，P=0.001)，miR-155表达水平与尿蛋白呈正相关(r=0.375，P=0.045)，miR-155的表达水平与eGFR呈负相关（r=-0.59，P=0.001）。miR-200a的表达水平与eGFR之间无明显相关性(r=0.22，P=0.242)。结论肾组织中miR-155和miR-200a在狼疮性肾炎患者与健康对照组之间的表达水平有差异，且它们的表达水平与蛋白尿、肾功能及狼疮评分均相关。提示LN患者组织中miR-200a与miR-155的表达与LN患者肾功能恶化和狼疮疾病活动程度密切相关，可作为预测LN进展的重要标志物。

狼疮性肾炎；miR-155；miR-200a

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统自身免疫性疾病，它的特征是靶向核的自身抗体的产生引起了多器官的广泛免疫病理损害。免疫复合物沉积在肾小球则导致狼疮性肾炎(LN)的发生[1]。microRNAs (miRNAs)是一种内源性、非编码、单链长度为18～24个核苷酸的小分子RNA，在转录后水平调节基因的表达[2]。多种miRNA在狼疮性肾炎患者与健康对照组之间的表达存在差异[3]。有研究表明LN患者血清和尿液中的多种miRNAs水平与健康对照组相比存在差异。而另外一些研究证实，肾活检组织中LN患者的miRNAs与健康对照组相比，一部分miRNAs表达下调而另外一部分miRNAs表达上调[4]。本研究应用荧光实时定量PCR(RT-PCR)方法研究LN患者肾组织中miR-155及miR-200a的表达情况，寻找与LN相关的生物学标记物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年4月至2014年1月间在我院经肾穿刺活检诊断为LN的患者30例。选取了被切除肾癌组织且没有任何形态学证据表明存在肾脏疾病的15例健康肾组织作为对照。临床资料包括血清补体水平、血清肌酐、尿蛋白、血清超敏C-反应蛋白(hsCRP)等，肾穿刺活检当天的狼疮活动程度由系统性红斑狼疮疾病活动指数评分(SLEDAI)[5]来评估，肾小球滤过率(eGFR)由MDRD方程评估。

1.2 主要试剂 miRSOL body fluid miRNA isolation kit(Cat.No.AB-MIS-001，AB-MIS-002)(深圳市盎然生物技术有限公司，中国)；S-Poly(T)miRNA qPCR-assay(Cat.No.AB-MAS100001-AB-MAS86581) (深圳市盎然生物技术有限公司，中国)。.

1.3 主要仪器 Real-time PCR仪(ABi7300)；低温台式离心机(Sigma公司，德国)。

1.4 研究方法

1.4.1 miRNA提取 按miRSOL body fluid miRNA isolation kit说明书操作进行RNA提取。每个石蜡组织切除20 μm切片共10片置于EP管中，在放油石蜡组织的EP管中加入适量的RNAiso Plus后匀浆，室温静置5 min，12 000 r/min 4℃离心5 min，上清液移至新的1.5 ml EP管中。加入1/5 RNAiso Plus体积量的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20 s后室温静置5 min，之后12 000 r/min 4℃离心15 min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色的上清液含miRNA。吸取500 μl上清液转移至另一新的1.5 ml离心管中，向上清液中加入等体积的异丙醇(500µl)，上下颠倒充分混匀，室温静置10 min后12 000 r/min 4℃离心10 min。弃去上清液，向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，轻轻颠倒，清洗沉淀后12 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清。最后沉淀室温干燥2～3 min，加入10µ1 RNase-free水溶解，溶解产物置于-80℃储存。

1.4.2 miRNA的逆转录 按照S-Poly(T)miRNAqPCR-assay试剂盒说明书操作，将提取的miRNA逆转录成cDNA，按说明书将miRNA10 μl加入反应体系中。miR-200a和miR-155逆转录反应条件：37℃保温30 min，42℃保温30 min，75℃加热5 min，冰上放2 min。逆转录后可进行荧光实时定量PCR。

1.4.3 荧光实时定量PCR 按S-Poly(T)miRNA qPCR-assay试剂盒说明书操作进行荧光实时定量PCR。整个反应体系20 μl，cDNA稀释5倍，10× selfTaqBuffer 2 μl，2 mmol/L、dNTP mix 2 μl，SelfTaqPolymerase 0.5 μl，10µmol/L正向引物0.4 μl，10µmol/L反向引物(5 862)0.4µl，10µmol/L探针0.5 μl，ROX Reference Dye(100X，Sigma)0.2µl，稀释cDNA 8 μl，6µl，每一个miRNA做2次。反应条件：95℃30 s 1个循环；95℃10 s，60°C 30 s 40个循环。在Real-time PCR仪(ABi7300)上进行荧光实时定量PCR。

1.4.4 数据分析 以外源snor44为内参，表达量以2^-ΔCt表示，其中ΔCt=AVG(检测的miRNA)-AVG(内参基因)；采用副孔检测，AVG为检测miR-200a及miR-155CT值。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。服从正态分布的定量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验。不服从正态分布定量资料以中位数和极值表示，两组间比较采用秩和检验。指标间量变关系采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人口学及临床资料比较 本组30例LN患者中男女比例为1:29；平均年龄(30.57±10.82)岁，GFR为(97.66±40.29)ml/(min·1.73 m2)，24 h尿蛋白定量(2.54±2.48)g，C3水平(0.55±0.26)g/L，C4水平(0.06±0.03)g/L，C反应蛋白(5.09±5.03)mg/L，狼疮评分为(15.47±4.86)分。30例LN患者中，3例组织学诊断为系膜增生型(Ⅱ型)，2例为局灶节段型(Ⅲ型)，20例为弥漫增生型(Ⅳ型)，2例为(Ⅳ+Ⅴ型)，3例为膜型(Ⅴ型)。

2.2 LN患者与健康对照组肾组织中miRNA的表达水平比较 LN患者肾组织中miR-155的表达水平高于健康对照组，miR-200a的表达水平低于健康对照组，且差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)，见图1。

2.3 LN患者肾组织中miRNA表达与临床指标之间的相关性 肾组织中miR-155(r=-0.59，P=0.001)与eGFR呈负相关，差异具有统计学意义(P＜0.05)。miR-200a(r=0.22，P=0.242)的表达水平与eGFR无明显相关性(P＞0.05)，见图2。肾组织中miR-155(r= 0.593，P=0.001)表达水平与狼疮评分呈正相关，miR-200a(r=-0.391，P=0.032)的表达水平与狼疮评分呈负相关，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。肾组织中miR-155(r=0.375，P=0.045)表达水平与尿蛋白呈正相关，miR-200a(r=-0.395，P=0.034)的表达水平与尿蛋白呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

图1 LN患者与健康对照组肾组织中miRNA的表达

图2 LN患者肾组织miRNA水平与GFR之间的相关性

图3 LN患者肾组织miRNA水平与狼疮评分之间的相关性

图4 LN患者肾组织miRNA水平与尿蛋白之间的相关性

3 讨论

最近的一些研究证实，miRNAs能够在各种来源，例如组织，血清和其他体液中被检测到。miRNAs在各种恶性和非恶性疾病，包括癌症，炎症和自身免疫性疾病中的作用是显而易见的，并且有越来越多的证据证明miRNA在SLE及LN中也发挥了重要作用[6]。

在本研究中，我们发现肾组织中miR-155及miR-200a的表达水平在LN患者和正常对照组之间存在差异，并且，miRNA表达水平的改变与临床疾病的严重程度密切相关。结果表明，这些miRNA的表达可能在LN的发病机制中起一定作用。

有研究发现，相比健康对照者或非活动性SLE患者，活动性SLE患者循环中调节性T细胞在其他CD4+T细胞中的比例下降得到了证实。调节性T细胞缺陷也被证明了与疾病的严重度相关。有研究发现，对比非自身免疫性小鼠，MRL/lpr小鼠调节性T细胞中的miR-155有所上调[7]。miR-155和miR-155*可以共同调节Ⅰ型干扰素在浆细胞样树突细胞的产生，为狼疮性肾炎的发病提供了潜在依据[8]。Te等[9]发现血清miR-155的表达水平在SLE患者中比健康对照组降低，而在非裔美国人外周血单个核细胞中它的表达水平上调。Wang等[10]测定了40例LN患者尿液沉渣中的miR-155水平并与13名健康对照组比较，发现LN患者尿液沉渣中miR-155的表达水平显著升高，且与蛋白尿程度及狼疮评分呈正相关。

肾脏损害是系统性红斑狼疮最严重的并发症之一，有相当一部分的患者伴随有蛋白尿和肾功能异常。在LN肾间质纤维化的进程中，肾小管上皮细胞转分化(EMT)发挥着重要的作用[11]。研究表明E-box抑制因子1(ZEB1)和E-box抑制因子2(ZEB2)能与上皮细胞内的E-钙黏着蛋白(E-cadherin)基因的启动子序列中的E-box(CACCTC/G)序列结合而抑制其转录，从而促进EMT的发生[12]。Wang等[13]测定40例LN患者血清和尿液中的miRNAs水平并与健康对照组相比较，结果发现血清与尿液中的miR-200家族(比如miR-200a、miR-141)、miR-205和miR-192，可以抑制ZEB1或ZEB2的表达。这些miRNA在LN患者血清中的表达下调，而miR-200家族、miR-192在LN患者尿液中的水平下调。血清中的miR-200a与蛋白尿程度呈负相关，并且与狼疮评分呈负相关。

本研究发现，组织中miR-155的表达水平在狼疮性肾炎患者中高于健康对照组，并且它的表达水平与eGFR呈负相关，与尿蛋白及狼疮评分呈正相关，差异具有统计学意义。miR-200a肾组织中的表达水平在狼疮性肾炎患者中低于健康对照组，miR-200a的表达水平与尿蛋白及狼疮评分呈负相关，与eGFR之间无明显相关关系。总的来说，我们的研究结果提示LN患者肾组织中miR-200a、miR-155表达水平的差异与LN患者肾功能恶化和狼疮疾病活动程度密切相关，可作为预测LN进展的重要标志物。

本研究有自身的局限性。第一，由于标本量较小，我们没有足够的统计学数据进行狼疮性肾炎组织学分型之间的比较，需要较大样本来做进一步研究。第二、本研究是单中心横断面研究，未对同一患者治疗前后做重复肾穿刺活检，从而对疗效进行前瞻性研究，还需要搜集更多临床数据做进一步研究。

综上所述，LN患者肾组织中miR-155的表达水平高于健康对照组，且其表达水平与eGFR呈负相关，与尿蛋白及狼疮评分呈正相关。LN患者肾组织中miR-200a的表达水平低于健康对照组，miR-200a的表达水平与尿蛋白及狼疮评分呈负相关。肾组织中miR-200a、miR-155表达水平的差异与LN患者肾功能恶化和狼疮疾病活动程度密切相关，可作为预测LN进展的重要标志物。

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Expression of miR-200a and miR-155 in renal tissue of patients with lupus nephritis and its mechanisms.

PAN Wu-shan1,HE Yong-cheng2,CHEN Hong-tao2.1.Graduate School,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,CHINA;2.Department of Nephrology,Shenzhen Second People's Hospital,Shenzhen 518035, Guangdong,CHINA

Objective To investigate the expression of miR-200a and miR-155 in the renal tissue of patients with lupus nephritis(LN),and to analyze its role in the pathogenesis of LN.MethodsWe quantified the expression level of miR-200a and miR-155 in the renal tissue of 30 patients with LN and 15 healthy controls through real-time PCR.ResultsCompared with health controls,the miR-155 level in LN patients was higher,and miR-200a level in LN patients was lower,with statistically significant difference(P＜0.001).miR-200a expression was negatively correlated with proteinuria(r=-0.395,P=0.034)and SLEDA(r=-0.391,P=0.032).miR-155 expression was positively correlated with proteinuria(r=0.375,P=0.045)and SLEDA(r=0.593,P=0.001),while miR-155 expression was nagatively correlated with estimated GFR(r=-0.5,P=0.001).miR-200a expression showed no significant correlation with estimated GFR (r=0.22,P=0.242).ConclusionThe miR-155 and miR-200a are differentially expressed in the renal tissue of LN patients and normal controls,and their expressions are closely related to the proteinuria,renal function and SLEDA.miR-155 and miR-200a expression in renal tissue are closely related to the degree of deterioration of renal function and lupus disease activity,which can serve as important targets in the pathogenesis of lupus nephritis.

Lupus nephritis;miR-155;miR-200a

R593.24+2

A

1003—6350（2015）10—1423—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0509

2014-05-08)

何永成。E-mail：heyongcheng@medmail.com.cn