VASH1在口腔鳞状细胞癌、口腔白斑及口腔扁平苔藓中的表达及意义

孙 鑫，魏秀峰，吕珊珊，刘 桐，安欢欢，李 娜，谷 楠

(吉林大学口腔医院口腔黏膜病科，吉林 长春 130021）

·临床病理·

VASH1在口腔鳞状细胞癌、口腔白斑及口腔扁平苔藓中的表达及意义

孙 鑫，魏秀峰，吕珊珊，刘 桐，安欢欢，李 娜，谷 楠

(吉林大学口腔医院口腔黏膜病科，吉林 长春 130021）

目的 探讨血管生成抑制蛋白1(VASH1)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)、口腔白斑(OLK)和口腔扁平苔藓(OLP)中的表达及意义。方法免疫组织化学染色SP法检测60例OSCC、20例OLK、20例OLP及20例正常口腔黏膜(NOM)中VASH1的表达情况，采用SPSS19.0软件对结果进行统计学分析。结果(1)VASH1蛋白在OSCC组织中的阳性表达率和染色强度随组织分化程度的降低而呈增高趋势(P＜0.05)，并且在中、低分化的鳞状细胞癌中的表达明显高于白斑，差异有统计学意义(P＜0.05)；(2)VASH1在白斑中的表达明显高于正常组织和扁平苔藓，且差异有统计学意义(P＜0.05)；(3)VASH1在扁平苔藓与正常组织的表达情况差异无统计学意义(P＞0.05)；(4)口腔鳞癌组中VASH1在有淋巴转移组的表达明显高于无淋巴转移组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论VASH1蛋白可能与口腔鳞状细胞癌的发生、发展及转移有关。

血管生成抑制蛋白1；口腔鳞状细胞癌；口腔白斑

口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是发生在口腔黏膜中最常见的恶性肿瘤。口腔鳞癌常向区域淋巴结转移，晚期可发生远处转移，其分化程度越低，恶性程度越高。口腔白斑(Oral leukoplakia，OLK)是最常见的口腔癌前病变，有3%～5%的口腔白斑会转变为口腔鳞状细胞癌。口腔扁平苔藓(Oral lichen planus，OLP)是较常见的口腔黏膜斑纹类疾病，目前多认为口腔扁平苔藓是一种癌前状态[1]。血管生成抑制因子(Vasohibin-1，VASH1)作为新近发现的蛋白因子，其具有负反馈调节血管生成的作用，是由血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纤维生长因子2 (Fibroblast growth factor-2，FGF2)等诱导产生，在乳腺癌[2]、食管鳞状细胞癌[3]、尿路上皮癌等肿瘤[4]中不仅可以抑制肿瘤的血管生成，而且对于肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移也有强大的抑制作用[5]，目前关于VASH1在口腔中的表达情况尚未见报道。本研究采用免疫组化SP法检测OSCC、OLK、OLP和NOM中VASH1蛋白的表达，并探讨其表达与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取吉林大学口腔医院病理教研室保存的60例口腔鳞状细胞癌(高分化、中分化和低分化鳞癌各20例)石蜡标本，20例口腔白斑和20例口腔扁平苔藓石蜡标本；选取20例正常口腔黏膜(Normal oral mucosa，NOM)作为对照。60例OSCC患者中男性40例，女性20例；年龄34～74岁，平均56.18岁；按照国际抗癌联盟UICC2002年修订的TNM分期标准，其中Ⅰ期21例，Ⅱ期16例，Ⅲ期22例，Ⅳ期1例；有淋巴结转移24例，无淋巴结转移36例。

1.2 实验试剂 兔抗人VASH1抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；SP试剂盒及DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司，阳离子防脱玻片购于北京中杉金桥生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)。

1.3 免疫组化染色 标本常规石蜡包埋，切片厚2 μm，具体染色步骤如下：蜡切片脱蜡和水化后，置煮沸的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)中抗原修复15 min后，冷却至室温，PBS冲洗，内源性过氧化酶阻断剂(试剂A)室温孵育10 min，PBS冲洗，非免疫羊血清(试剂B)室温孵育10 min，试净勿洗，加入一抗VASH1(兔抗人，稀释比例为1:400)4℃冰箱孵育过夜，复温，PBS冲洗，滴加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG (试剂C)室温孵育10 min，PBS冲洗，滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(试剂D)室温孵育10 min，PBS冲洗。用新鲜配制的DAB染色，而后自来水充分冲洗，苏木素复染，分化，返蓝，脱水透明，封片。以PBS代替第一抗体为阴性对照。

1.4 结果判定 根据相关文献[1，3]判定标准，VASH1的阳性表达以细胞质和(或)细胞膜呈淡黄色至棕褐色颗粒状着色为阳性细胞。每张切片选取8个200倍视野观察，采用双盲法判定结果，同时由两位资深病理科医师独立评分。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比：0为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。以两项得分的乘积作为总分，总分≥4分为阳性。总分为4～6分为弱阳性，记为(+)；6～8分为中度阳性，记为(++)；＞8分为强阳性，记为(+++)。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，样本率的比较采用χ2检验，以α=0.05作为显著性检验的标准，以双侧P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 VASH1在口腔鳞癌、口腔白斑、口腔扁平苔癣及正常口腔黏膜中的表达情况 VASH1在正常口腔黏膜和口腔扁平苔藓中多为阴性或弱阳性表达，在口腔扁平苔藓中70.00%为阴性表达，25.00%为弱阳性表达，仅有5.00%为中度阳性表达；在正常口腔黏膜中85.00%为阴性表达，15.00%为弱阳性表达；在口腔白斑中30.00%为阴性表达，30.00%为弱阳性表达，30.00%为中度阳性表达，10.00%为强阳性表达；在口腔鳞癌中20.00%为阴性表达，18.33%为弱阳性表达，30.00%为中度阳性表达，31.67%为强阳性表达，见图1～图6及表1。

图1 正常口腔黏膜（×200）

图2 扁平苔藓（×200）

图3 口腔白斑(×200)

图4 高分化鳞状细胞癌(×200)

图5 中分化鳞状细胞癌(×200)

图6 低分化鳞状细胞癌(×200)

表1 VASH1在OSCC、OLK、OLP及NOM中的表达情况(例)

2.2 VASH1在口腔鳞癌中的表达情况与临床病理特点的相关性 VASH1在口腔鳞癌中的表达明显高于口腔扁平苔藓和正常口腔组织，且差异有统计学意义(P＜0.05)；VASH1在口腔白斑中的表达也明显高于口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织，差异有统计学意义(P＜0.05)；VASH1在口腔鳞癌中的表达随着分化程度的降低而逐渐增强，且VASH1表达与肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴转移差异有统计学意义(P＜0.05)，但与患者的性别、年龄无关(P＞0.05)，见表2。

表2 OSCC组织中VASH1蛋白表达与各临床参数的关系[例(%)]

3 讨 论

VASH是由VEGF和FGF2诱导的具有抑制血管生成的基因，由研究者通过DNA微阵列分析在血管内皮细胞中发现的[6]。VASH有两个同系物，即VASH1及VASH2[7]，VASH1被认为是一种来源于内皮细胞的负性调节血管新生的蛋白[8]，而VASH2则是一种不依赖于VEGF的且非内皮细胞所固有的促血管生成因子[9]。VASH1具有抑制血管生成的作用，并表达于血管内皮细胞、心肌及横纹肌[10]等，在血管发芽之前终止血管生成，还能够抑制肿瘤的发展和淋巴结转移[11]。

近年的研究发现VASH1在多种恶性肿瘤中存在高表达。本研究对NOM、OLP、OLK和OSCC中VASH1的表达进行了检测，结果显示：VASH1在NOM中低表达，与Yoshinaga等[12-13]的结论相近；在OSCC发展的过程中，VASH1的表达强度随病理分级的升高而增强，这与郭晓峰等[3]对VASH1在食管鳞状细胞癌中的研究结论相同；VASH1在OSCC中的表达明显高于NOM，差异有统计学意义，提示OSCC的发病可能与VASH1的表达存在着内在联系；VASH1在OLK中的表达也明显高于OLP和NOM，差异有统计学意义，表明相比于OLP和NOM，OLK与VASH1表达的相关性更为密切；VASH1在OSCC中的表达随着分化程度的降低而逐渐增强，表明VASH1与OSCC的分化程度密切相关；OSCC中VASH1表达与TNM分期及有无淋巴转移差异有统计学意义，表明VASH1的表达与OSCC的TNM分期及有无淋巴结转移相关。我们推测OSCC中VASH1的表达增高可能是由于机体负反馈调节，拮抗血管生长促进因子，而出现高表达。

综上所述，VASH1在OSCC中的表达随着分化程度的降低而逐渐升高，即分化程度越差，VASH1的表达越高；VASH1在OSCC中也有较高的表达，可能与其易癌变有一定的关系，但其具体机制尚不明确，仍有待探讨；VASH1表达与OSCC的分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移相关，可能与OSCC的发生、发展及转移有关。VASH1具有抑制肿瘤血管和淋巴管生成的作用，有望成为抗OSCC血管形成及肿瘤治疗的新方法，但其与口腔黏膜癌前病变癌变机制、口腔鳞癌的发病机制以及临床应用仍需进一步探索。

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Expression and significance of VASH1 protein in oral squamous cell carcinoma,oral leukoplakia and oral lichen planus.

SUN Xin,WEI Xiu-feng,LV Shan-shan,LIU Tong,AN Huan-huan,LI Na,GU Nan.Department of Oral Mucosal Disease Office,Hospital of Stomatology,Jilin University,Changchun 130021,Jilin,CHINA

ObjectiveTo explore the expression of vasohibin1(VASH1)in oral squamous cell carcinoma (OSCC),oral leukoplakia(OLK),oral lichen planus(OLP).MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of VASH1 in 60 cases of OSCC,20 cases of OLK,20 cases of OLP and 20 cases of normal oral tissue. SPSS19.0 was used for statistical analysis.Results(1)The positive expression and staining intensity of VASH1 protein in the OSCC tissue showed an increasing trend with the decreasing of the tissue differentiation degree(P＜0.05). The expression of VASH1 in moderately and poorly differentiated OSCC was significantly higher than that in OLK (P＜0.05).(2)The expression of VASH1 in OLK was significantly higher in that in normal oral mucosa(NOM)and OLP(P＜0.05).(3)The expression of VASH1 in OLP and NOM showed no statistically significant difference(P＞0.05).(4)The expression of VASH1 in oral squamous cell carcinoma with lymph node metastsis group was significantly higher than that without lymph node metastasis group(P＜0.05).ConclusionVASH1 protein may be related to the occurrence of OSCC,development and metastasis.

Vasohibin1(VASH1);Oral squamous cell carcinoma(OSCC);Oral leukoplakia(OLK)

R739.85

A

1003—6350（2015）23—3560—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1288

2015-05-12)

魏秀峰。E-mail：xfw79@sina.com