α-硫辛酸对慢性脑低灌注大鼠脑单胺类神经递质和单胺氧化酶的影响

赵冉冉，徐晓臣，王 玲，路志民，张文忠，刘吉祥

(邯郸市第一医院急诊科1、神经内科2、泌尿科3、神经外科4，河北 邯郸 056002)

α-硫辛酸对慢性脑低灌注大鼠脑单胺类神经递质和单胺氧化酶的影响

赵冉冉1，徐晓臣2，王 玲1，路志民3，张文忠1，刘吉祥4

(邯郸市第一医院急诊科1、神经内科2、泌尿科3、神经外科4，河北 邯郸 056002)

目的 观察α-硫辛酸(ALA)对慢性脑低灌注(CCH)血管性痴呆大鼠单胺类神经递质和单胺氧化酶的影响。方法健康成年雄性Wistar大鼠60只随机分为假手术组(SHAM组)、慢性脑低灌注组(CCH组)、低剂量治疗组(L-ALA组，50 mg/kg)和高剂量治疗组(H-ALA组，100 mg/kg)，每组15只。利用双侧颈动脉结扎术制备慢性脑低灌注模型，SHAM组手术步骤与CCH组相同但不结扎颈总动脉。从实验第29天起Morris水迷宫检测动物认知功能，水迷宫结束后取材，采用高效液相色谱仪检测去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)在大鼠前脑皮层的水平，分光光度计检测前脑皮层单胺氧化酶(MAO)的水平。结果与SHAM组比较，CCH组大鼠前脑皮层NE、DA和5-HT的含量均显著下降，MAO含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCH组比较，低剂量ALA和高剂量ALA治疗均能显著提高CCH大鼠前脑皮层组织的NE、DA和5-HT含量，降低MAO水平，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论α-硫辛酸能够明显改善CCH大鼠的行为学异常，调节CCH大鼠脑内单胺类神经递质系统。

慢性脑低灌注；α-硫辛酸；单胺类神经递质；单胺氧化酶

血管性认知功能障碍(Vascular cognitive impairment，VCI)是指由各种心、脑血管病而引起的获得性学习、记忆功能下降。随着社会人口逐渐老龄化，心脑血管病发病率明显增加，同时，医疗水平的进步使得心脑血管疾病生存率提高，VCI的发病呈快速增长的趋势，造成生活质量的下降，严重威胁人类身心健康[1]。然而，血管性认知功能障碍的发病机制尚未明确，目前尚无有效改善血管性认知功能障碍的方法，临床急切需要治疗VCI的特效药物。本研究通过双侧颈总动脉结扎制备慢性脑低灌注血管性认知功能障碍大鼠模型，观察并探讨α-硫辛酸对血管性认知功能障碍大鼠行为学和脑单胺类神经递质、单胺氧化酶的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和模型制备 健康成年雄性Wistar大鼠共60只，体质量(260±20)g，购自河北医科大学实验动物中心。按照随机数字表法分为假手术组(SHAM组)、慢性脑低灌注组(CCH组)、低剂量治疗组(L-ALA组，50 mg/kg)和高剂量治疗组(H-ALA组，100 mg/kg)，每组15只；麻醉采用10%的水合氯醛腹腔注射方式，在动物麻醉后仰卧位固定，颈前区消毒，沿颈前正中做纵行的切口，逐层切开皮肤、皮下组织，然后小心地钝性分离出双侧的颈总动脉，避免刺激颈动脉窦，随后用丝线依次结扎住双侧颈总动脉的近心端和远心端，在两个结扎点间将动脉剪断，缝合皮肤。术毕将动物放回笼中。密切观察大鼠精神状态、饮食等一般情况。在手术过程中假手术组大鼠仅仅是分离双侧颈总动脉，而不结扎双侧颈总动脉，其他步骤不变。术后24 h起，SHAM组和CCH组每日腹腔注射生理盐水，L-ALA组和H-ALA组给予相应的ALA腹腔注射，每日一次，共28 d。

1.2 主要药品和试剂α-硫辛酸由Sigma公司提供，去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)标准品均由中国生物药品制品检定所提供，MAO检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 Morris水迷宫试验 自术后第29天起进行Morris水迷宫试验，来评价各组大鼠的认知功能。其中，第29～33天动物进行定向航行试验，试验具体内容是将动物分别从四个象限入水，大鼠从入水到爬上平台所花费的时间记录为逃避潜伏期，取4次逃避潜伏期的均值为当日的逃避潜伏期并进行分析；第34天动物进行空间探索试验，水迷宫中的平台撤除后将大鼠从固定的一个象限入水，观察大鼠入水后2 min里在平台所在象限的游泳时间。

1.4 NE、DA、5-HT检测 Morris水迷宫试验结束后各组动物采用断头取脑的方法取材，冰盘上快速分离前脑皮层组织并称湿重后，按1：10(mg：μl)比例与预冷的高氯酸混合，随后在冰浴中制备为10%的脑皮层组织匀浆，离心并取上清液进行下一步的检验，采用液相高效色谱仪分析各指标含量。

1.5 单胺氧化酶(MAO)检测 Morris水迷宫试验结束后采用大鼠断头取脑的方法取材，冰盘上快速分离出前脑皮层组织，称湿重后加冰生理盐水制备成10%匀浆，按照试剂盒说明书进行具体实验步骤。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0软件对本研究中的实验数据进行统计分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示，重复测量设计的方差分析用于水迷宫实验中逃避潜伏期的数据分析，其他数据采用one-way ANOVA进行统计分析，两组间比较采用LSD，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫结果 与SHAM组比较，CCH组大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期显著延长，与CCH组比较，α-硫辛酸治疗的两组动物，L-ALA组和H-ALA组大鼠在定向航行实验中的逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.05)；空间探索实验结果显示，与SHAM组比较，CCH组大鼠目标象限的游泳时间显著缩短，L-ALA组和H-ALA组与CCH组相比在目标象限的游泳时间显著增加(P＜0.01)；在逃避潜伏期和目标象限游泳时间两个指标上，高剂量ALA的改善作用更好。在各组大鼠间游泳速度差异无统计学意义，见表1。

表1 α-硫辛酸对Morris水迷宫表现的影响

2.2α-硫辛酸对脑内单胺类神经递质和MAO的影响 与SHAM组比较，CCH组大鼠前脑皮层内NE、DA和5-HT水平均明显下降(P＜0.05)，MAO的水平明显升高(P＜0.05)；低剂量和高剂量α-硫辛酸治疗均能明显缓解脑内单胺类神经递质紊乱，表现为明显升高了血管性认知功能障碍大鼠前脑皮层中NE、DA和5-HT水平(P＜0.05)，显著降低了MAO水平(P＜0.05)；L-ALA组NE、DA、5-HT和MAO仍未达到SHAM组的正常水平，H-ALA组各项指标水平与SHAM组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 α-硫辛酸对前脑皮层NE、DA、5-HT和MAO含量的影响(±s)

表2 α-硫辛酸对前脑皮层NE、DA、5-HT和MAO含量的影响(±s)

注：a与假手术组比较，P＜0.05；b与CCH组比较，P＜0.05。

组别SHAM组CCH组L-ALA组H-ALA组F值P值NE (ng/g) 268.1±21.9 176.9±11.2a211.6±19.1ab259.4±22.3b29.007 0.001 DA (ng/g) 533.1.±52.8 298.7±21.1a402.3±38.7ab519.9±48.7b49.281 0.001 5-HT (ng/g) 468.9±41.3 299.3±19.1a349.9±32.5ab450.5±41.8b39.783 0.001 MAO [U/(h·mg·prot)] 16.98±1.34 30.73±2.57a22.68±2.19ab17.84±1.25b3.338 0.001

3 讨论

慢性脑低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是血管性认知功能障碍和阿尔茨海默病中常见的病理状态[1]，CCH可由高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、吸烟等因素诱发。CCH与脑血管功能状态密切相关，是导致血管性痴呆(VD)的主要原因[2]。临床研究和动物实验的结果均表明，CCH可导致认知功能损伤[3-4]。存在有CCH的患者常出现不同程度的认知功能障碍。由于CCH在痴呆中的重要作用，CCH已经成为神经科学研究的前沿和热点。近年来的研究发现，CCH可通过氧化应激、神经递质紊乱和促炎因子的释放等机制导致神经退行性改变，进而导致神经元损害和白质的损害[5-6]。动物实验中发现，双侧颈总动脉结扎术后脑组织中脂质过氧化和氧化性DNA损伤均明显增加[7]，因此抗氧化治疗有可能是治疗血管性认知功能障碍的有效策略。

学习和记忆功能的下降是血管性认知功能障碍患者的主要临床表现。从发病机制上看，中枢神经系统中神经递质与学习记忆密切相关，除了胆碱能神经递质系统与认知联系密切外，中枢神经系统单胺类神经递质在学习和记忆过程中发挥了重要的易化作用，单胺类神经递质正常的合成及释放是学习和记忆功能的生化基础。有研究报道，在血管性认知功能障碍的患者中发现，中枢单胺类神经递质含量的下降与认知功能的下降密切相关，上调中枢神经系统单胺类神经递质的含量可能具有增强认知功能的作用。与此同时，脑内5-HT含量的下降也是血管性认知功能受损的典型表现[8]，5-HT再摄取抑制剂能有效增强学习和记忆功能[9]。

作为迄今为止发现的唯一同时具有水溶性和脂溶性的强效抗氧化剂，α-硫辛酸能够顺利通过血脑屏障从而发挥其神经保护作用。α-硫辛酸可通过以下机制减轻机体的氧化应激：直接清除活性氧自由基、与金属离子螯合进而减少活性氧自由基、使体内的内生性抗氧化物再生成并循环利用从而增强机体抗氧化防御、通过在体内转化为还原型二氢硫辛酸而显著增强自身抗氧化能力。既往的研究表明，α-硫辛酸对糖尿病及其并发症[10]、脑外伤[11]、阿尔茨海默病[12]、实验性自身免疫性脑脊髓炎[13]等都有显著的保护作用。作为能够改善认知功能的强抗氧化剂，α-硫辛酸是否在血管性认知功能障碍中也具有治疗作用，正是本研究所要探讨的问题。

本研究发现，CCH大鼠学习、记忆能力明显下降，α-硫辛酸治疗4周后CCH大鼠认知功能得以明显改善，且改善作用与剂量相关；检测大鼠前脑皮层中单胺类神经递质含量发现，CCH大鼠前脑皮层中单胺类神经递质DA、NE和5-HT的含量均明显下降，MAO的含量显著升高，而α-硫辛酸治疗4周后可明显改善单胺类神经递质的紊乱。表明ALA对血管性认知功能障碍大鼠有明显的治疗作用，同时ALA能够调节脑皮层单胺类神经递质含量。但是ALA究竟是通过何种机制调节了单胺类神经递质的含量，还有待进一步研究。

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Effects of alpha-lipoic acid on monoamine transmitters and monoamine oxidases in rats with chronic cerebral hypoperfusion.

ZHAO Ran-ran1,XU Xiao-chen2,WANG Ling1,LU Zhi-min3,ZHANG Wen-zhong1,LIU Ji-xiang4. Department of Emergency1,Department of Neurology2,Department of Urology3,Department of Neurosurgery4,the First Hospital of Handan,Handan 056002,Hebei,CHINA

Objective To explore the effects of alpha-lipoic acid(ALA)on monoamine neurotransmitters and monoamine oxidase in rats with chronic cerebral hypoperfusion(CCH).MethodsSixty healthy adult male Wistar rats were randomly assigned into four groups:SHAM group,CCH group,low-dose ALA therapy group(50 mg/kg)and high-dose ALA therapy group(100 mg/kg).Bilateral common carotid arteries occlusion was used in healthy adult male Wistar rats to establish CCH model.Rats in SHAM group were operated similarly to CCH group without occlusion of common carotid arteries.Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function.HPLC was used to detect the levels of norepinephrine(NE),dopamine(DA)and 5-hydroxytryptamine(5-HT)in the forebrain cortex,and monoamine oxidase(MAO)was measured spectrophotometrically.ResultsCompared with SHAM group,the contents of NE,E,DA and 5-HT significantly decreased and MAO significantly increased in the CCH group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).Both low-dose ALA and high-dose ALA could significantly increase NE,DAand 5-HT levels,and significantly decrease MAO level in the CCH rats(P＜0.05).ConclusionALAcould significantly improve behavioral alterations and restore central monoamine neurotransmitters system in rats with chronic cerebral hypoperfusion.

Chronic cerebral hypoperfusion(CCH);Alpha-lipoic acid(ALA);Monoamine transmitter; Monoamine oxidase

R-332

A

1003—6350（2015）23—3440—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1248

2015-05-22)

赵冉冉。E-mail：a34251900@163.com