纳米银支架治疗重症胆管炎的机制及抗菌性研究

呼增吉，贾长库，韩 霖，符 誉，黄小龙

（海南医学院附属医院肝胆外科，海南 海口 570103）

·论 著·

纳米银支架治疗重症胆管炎的机制及抗菌性研究

呼增吉，贾长库，韩 霖，符 誉，黄小龙

（海南医学院附属医院肝胆外科，海南 海口 570103）

目的 研究内镜下纳米银支架治疗急性重症胆管炎(ACST)的机制及纳米银支架的抗菌性。方法将20头猪随机分为纳米银支架组(n=8)、普通支架组(n=8)和对照组(n=4)。对照组采用内镜下逆行胆管造影(ERC)，胆总管内注入大肠杆菌，乳头口用钛夹夹闭，封闭乳头。支架组在造模成功后行ERC+支架置入，支架末端在乳头口处以钛夹固定。观察术后猪的一般情况，分别于术前、术后1 d、3 d、5 d采集猪血检测其白细胞计数、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血清胆红素(TB)、血清肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)，观察猪死亡后的胆管病理改变。结果三组猪术前的各项观察指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；术后对照组的白细胞及分类、ALT、ALP、TB、TNF-α和IL-1水平均逐步上升，且在各时点均明显高于两支架组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；纳米银支架组和普通支架组在术后第五天白细胞计数及分类、血清TNF-α和IL-1比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论细菌感染和胆道梗阻是ACST的主要病因，内镜下置入支架治疗ACST，微创有效，纳米银支架有抗菌性。

重症胆管炎；内镜；纳米银；支架；抗菌性

急性重症胆管炎(Acute cholangitis of servere type，ACST)亦称急性梗阻性化脓性胆管炎，是胆道感染和梗阻向严重阶段发展的过程，是胆道疾病的严重感染并发症。其起病急，发展快，常伴有感染性休克，病死率高。近年来，随着对ACST的深入研究及内镜技术在胆道疾病中的广泛应用，越来越多的ACST患者通过内镜治疗得到救治。本实验通过在内镜下逆行胆管造影术(Endoscopic retrograde cholangiography，ERC)建立猪的ACST模型，将纳米银支架置入胆管治疗ACST，研究纳米银支架治疗ACST的优越性及抗菌性。

1 材料与方法

1.1 纳米银支架制备方法 采用上海辛菖医疗器械公司生产的8.5F×6 cm聚丙烯塑料胆管支架为载体，以硝酸银为原料，采用化学氧化还原法将纳米银颗粒还原并使之沉积在聚丙烯塑料胆管支架表面，使支架管的内外表面均匀附着上纳米银颗粒。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与分组 本地杂种猪20头(海南医学院动物中心)，体重(16±2)kg，雌雄各半，健康无疾病。随机分为钠米银支架组(n=8)、普通支架组(n=8)和对照组(n=4)。

1.2.2 仪器与试剂 Pentax电子十二指肠镜，爱尔博高频电发生器，乳头切开刀，黄斑马导丝，纳米银涂层支架，塑料支架(8.5F×6 cm上海辛菖医疗器械公司)，碘海醇造影剂，大肠杆菌菌株(海南医学院附属医院微生物室)。

1.2.3 内镜下胆管炎造模(对照组) 猪禁水禁食24 h，全身麻醉后在猪口腔内置入一2 cm×12 cm自制的塑料套管，使门齿至咽部直线化(图1)。采用左侧卧位，电子十二指肠镜经塑料套管进入咽部，经食管、胃腔进入幽门，在幽门下方1.5～2 cm处找到十二指肠乳头，经乳头开口插入乳头切开刀(图2)，碘海醇造影剂进行胆管造影，证实为胆管后抽出造影剂，经乳头切开刀胆管内注入大肠杆菌1 ml，注射完毕后经乳头切开刀向胆管注入空气0.5 ml，然后用钛夹夹闭乳头开口。

图1 实验动物

图2 乳头插管

1.2.4 胆管塑料支架置入(支架组) 造模后待猪出现高热，脉率增快后，十二指肠镜再次进入猪十二指肠肠腔内，异物钳取出夹闭乳头口的钛夹，在预置支架的末端穿过一根4#丝线系成一线圈，沿导丝置入纳米银支架及塑料支架，用推送器将支架推送入胆管内，末端侧翼以下的支架留在十二指肠乳头外，钛夹通过线圈固定在乳头口，以防支架脱出。透视下观察支架的位置是否正常(图3)。

图3 X线下支架在位

1.3 观测指标

1.3.1 一般情况 记录各组猪的一般情况及病死率。

1.3.2 实验室检测 各组猪分别于术前、术后1 d、3 d、5 d采集猪外周静脉血，检测其白细胞数及分类、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphate，ALP)、血清胆红素(Total bilirubin， TB)、血清肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)。

1.3.3 病理检查 猪若出现死亡立即行病理解剖，了解死亡原因。术后第5天处死所有猪，取胆管组织行病理学检查。

1.4 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 支架组猪麻醉苏醒后即可进食，但活动量较术前有所减少，3 d后与术前比较无明显变化。对照组猪苏醒后进食量明显减少，出现精神萎靡不振，躁动不安，高热，呼吸急促，活动差，尿色深，分别于术后26 h、40 h、48 h、70 h死亡。

2.2 白细胞数及其分类 术前三组猪的白细胞及分类比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，术后对照组猪的白细胞及分类在各个时间点均明显高于普通支架组及纳米银支架组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；普通支架组与纳米银支架组在术后第5天白细胞计数及分类组间比较也有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.3 血清 TNF-α和 IL-1水平 术前三组TNF-α、IL-1的差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组术后TNF-α、IL-1在各时点明显高于普通支架组和纳米银支架组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；普通支架组与纳米银支架组在术后第五天血清TNF-α、IL-1组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.4 血清ALT、ALP和TB水平 术前三组ALT、ALP和TB的差异无统计学意义(P＞0.05)，术后对照组ALT、ALP和TB在各时点明显高于普通支架组和纳米银支架组，差异有统计学意义(P＜0.05)；术后普通支架组、纳米银支架组组间比较无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.5 病理改变 猪死亡后立即行病理解剖，腹腔内有腹水形成，胆管内见大量脓液(图4)。普通支架组胆管壁血管扩张充血，中性粒细胞广泛浸润，病理切片中见到大量中性粒细胞聚集，有小脓肿形成；纳米银支架组散在杯状细胞，血管轻度充血，少量中性粒细胞浸润。

图4 术后解剖

表1 三组手术前后血液多项指标的变化(±s)

表1 三组手术前后血液多项指标的变化(±s)

组别对照组普通支架组纳米支架组时间术前术后24 h术后72 h术后5 d术前术后24 h术后72 h术后5 d术前术后24 h术后72 h术后5 d白细胞计数(×109/L) 6.70±1.40 17.40±2.70 23.17±1.14 -5.90±0.85 15.30±1.80a13.60±4.30a11.17±4.10a7.20±0.62 11.35±2.50a9.23±1.50a7.33±2.14b中性粒细胞(%) 0.640±0.035 0.890±0.042 0.920±0.031 -0.683±0.045 0.861±0.020a0.802±0.035a0.750±0.031a0.653±0.043 0.935±0.026a0.650±0.012a0.42±0.015bTNF-α(pg/ml) 65.30±4.35 161.2±11.3a189.0±7.45a-55.30±6.30 133.1±15.4a103.2±13.4a93.40±6.10a62.40±7.60a96.10±4.65 89.60±6.41a66.10±4.65bIL-1(pg/) 75.60±15.20 192.1±20.45a256.4±29.70a-65.30±4.30 146.1±7.46a115.2±8.50a97.00±4.50a68.50±7.35a115.1±6.50a90.60±7.65a68.50±4.52bALT(U/L) 7.50±2.35 170.5±37.50 238.5±41.20 -7.30±1.50 56.0±10.60a33.10±5.60a26.10±4.80a7.40±1.24 45.10±8.90a27.10±4.90a30.10±3.50aALP(U/L) 44.20±12.23 178.0±38.50 376.5±61.80 -35.40±10.25 50.6±11.70a43.12±9.30a40.00±9.00a32.20±9.65 46.2±12.30a40.40±8.40a35.65±7.64aTB(μmmol/L) 8.50±2.54 156.50±37.4 232.00±41.20 -6.55±3.12 16.36±2.74a10.90±1.05a8.10±1.80a7.50±1.20 15.80±1.10a9.36±1.70a8.25±0.35a

注：TNF;血清肿瘤坏死因子，LL;白细胞介素，ALT;谷丙转氨酶，TB；血清胆红素。‘与对照组同时点比较，‘与普通支架组同时点比较，P<0.05。

3 讨 论

急性重症胆管炎(ACST)是急性胆管炎的严重阶段，起病急,病情发展快,常伴有脓毒症及感染性休克,病死率高。ACST的发病机制是由于胆道梗阻后胆道系统压力增高、经胆汁进入肝内的细菌直接返流进入血液，细菌大量繁殖引起胆管内化脓性感染，继而引起全身化脓性感染。因此胆道梗阻与细菌感染是重症胆管炎的发病基础。急性胆管炎时，如果胆道梗阻未解除，胆管内细菌引起的感染没有得到控制，逐渐发展至ACST并威胁患者的生命[1]。内镜下治疗ACST具有快速、方便、诊断准确、微创等优越性，目前已成为治疗ACST的主要手术方式[2-3]。

因为猪来源广，且与人类的解剖结构相近，实验用它来制作ACST模型。和其他实验者采用开腹手术建立模型不同，本实验采取内镜下通过十二指肠乳头行胆管插管来建立ACST模型，根据胆道梗阻和细菌感染是重症胆管炎发病的基础，在胆管内注射大肠杆菌,钛夹夹闭乳头口来制作ACST模型，该方法操作方便简单，模型可靠，微创，避免了开放手术对动物生理机能的干扰[4]。造模成功后，内镜下置入胆道支架，为防止支架脱落，支架末端缝扎一线圈，钛夹夹闭肠壁固定。结果表明，对照组动物苏醒后进食量明显减少，出现精神萎靡，烦躁不安，体温骤升，呼吸急促，活动差，最终导致死亡。支架组除进食及活动稍有减少外，一般情况与术前无明显变化；主要是支架组放置支架解除了梗阻，引流了感染灶，故症状较轻，术后恢复快。

在炎性反应过程中TNF-α出现最早而且是最重要的炎性介质,能够激活淋巴细胞和中性粒细胞，调节其他组织的代谢活性，促使其他细胞因子(如IL-6、IL-8等)的释放，是许多炎性反应的中心介质[5]。IL-1也是促炎细胞因子，是在全身炎症反应中起核心作用的细胞因子[6]。因此将炎症因子TNF-α，IL-1作为主要观察指标。术后对照组血清TNF-α，IL-1指标在各时点明显高于支架组(P＜0.05)。对照组因为大肠杆菌持续释放内毒素,内毒素是刺激细胞因子分泌最主要的物质，在内毒素等抗原的激活下，单核巨噬细胞系统产生和释放的多种细胞因子和炎性介质显著升高。而支架组由于胆道支架的引流作用使炎症的逐渐减轻。对照组血清ALT，ALP和TB水平显著高于支架组(P＜0.05)，可能与胆道梗阻后，胆道压力增高致细菌感染及内毒素反流造成肝脏损伤有关。

银是一种安全广谱的抗菌材料。银被纳米化后兼具银元素与纳米材料的特性，具有更优良的抗菌效果[7]。纳米银是指在1～100 nm之间的金属银微粒组成的粉体，是以纳米技术为基础研制而成的新型抗菌产品，由于其颗粒极其微小，表面积较大，使其具有显著的表面效应、量子尺寸效应和量子隧道效应，因而具有其他无机抗菌剂无可比拟的抗菌疗效，而且安全性高、持久强[8]。

术后5 d电镜下观察无论是普通支架组还是纳米银支架组均可观察到支架下段粘附细菌较中段、上段明显密集，提示接触十二指肠返流物机会多的部位细菌生物膜形成明显。普通支架粘附的细菌密集、菌群种类和数量多，而纳米银支架表面粘附的细菌明显较少，可见较多为结晶颗粒。国内外学者研究证实[9-10]，对包括金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、肠球菌、淋球菌、念珠菌等在内的十余种微生物的研究发现，纳米银对不同微生物的生物被膜的形成有不同的抑制作用。分析白细胞、TNF-α、IL-1发现，术后5 d纳米银支架组与术前比较差异无统计学意义(P＞0.05)，而普通支架组较纳米银支架组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。通过胆管组织学发现，虽然两组都有胆管壁组织水肿、血管充血扩张、炎症细胞的浸润，但普通支架组炎症更为严重，有的胆管壁内可以看到脓肿形成。结合术后白细胞水平、TNF-α、IL-1变化，笔者认为纳米银支架可以减少细菌生物膜的形成，抑制支架表面细菌的粘附，具有明显抗菌的作用。

本研究结果表明，细菌感染和胆道梗阻是ACST的主要发病因素，内镜下胆管内支架置入内引流微创治疗ACST疗效确切，纳米银胆管支架具有明显抗菌作用。

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Mechanism of nano silver stents in the treatment of acute cholangitis of severe type and the antibacterial property of nano silver stents.

HU Zeng-ji,JIA Chang-ku,HAN Lin,FU Yu,HUANG Xiao-long.Department of Heptatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570103,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the mechanism of nano silver stents in the treatment of acute cholangitis of severe type(ACST)and the antibacterial property of nano silver stents under endoscope.MethodsTwenty pigs were randomly divided into nano silver stent group(n=8),ordinary stent group(n=8)and control group(n=4).The control group was treated by endoscopic retrograde biliary imaging(ERC),followed by injectingE.colithrough bile duct and enclosing papilla with titanium clips.The nano silver stent group and ordinary stent group were treated by ERC combined with stent implantation,followed by enclosing papilla with titanium clips.The peripheral blood samples were collected pre-operatively and at 1 day,3 day,5 day post-operatively for detection of white blood cell(WBC),alanine aminotransferase(ALT),alkaline phosphate(ALP),total bilirubin(TB),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-1(IL-1).The pathological changes of bile duct were observed when the pigs were executed.ResultsThere were no significant differences between three groups pre-operatively.The changes of peripheral WBC,ALT,ALP,TB,TNF-αand IL-1 levels post-operatively in control group increased gradually,which were significantly higher than nano silver stent group and ordinary stent group(P＜0.05).The changes of peripheral WBC,TNF-αand IL-1 levels in ordinary stent group and nano silver stent group showed statistically significant difference at 5 day post-operatively(P＜0.05).ConclusionInfection and biliary obstruction are the main cause of ACST.Endoscopic stent implantation is minimally invasive for treatingACST,and nano silver stent has antimicrobial properties.

Acute cholangitis of severe type;Endoscope;Nano silver;Stent;Antibacterial property

R657.4+5

A

1003—6350（2015）23—3433—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1247

2015-06-30)

2013年海南省卫生厅课题(编号：琼卫2013—资助032号)

呼增吉。E-mail：huzengji@126.com