吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠学习记忆能力及海马内氧化应激的影响

樊有忠，赵珊珊

(1.镇安县医院内科，陕西 镇安711500；2.西安交通大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西 西安710061)

吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠学习记忆能力及海马内氧化应激的影响

樊有忠1，赵珊珊2

(1.镇安县医院内科，陕西 镇安711500；2.西安交通大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西 西安710061)

目的研究吡格列酮(Pioglitazone，Pio)对Aβ25～35引起的大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激反应的影响。方法将40只大鼠随机分为空白对照组、模型组、Pio低剂量组和Pio高剂量组，每组10只。Pio低剂量组和高剂量组大鼠分别给予吡格列酮40mg/kg和80mg/kg灌胃21 d，空白对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。治疗结束次日进行Morris水迷宫实验，前5 d定位航行训练，第6天进行空间探索实验。Morris水迷宫实验结束后次日，麻醉、断头取脑，提取脑组织匀浆，以备ELISA实验使用。ELISA法检测大鼠海马内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量。结果Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠潜伏期比空白对照组明显延长，而穿过平台次数和平台滞留时间缩短，差异均具有统计学意义(P＜0.05）；与模型组相比，Pio低剂量和高剂量组大鼠潜伏期显著降低，穿过平台次数和滞留时间也相应增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，其中Pio低剂量组增加显著；ELISA法检测结果显示，模型组大鼠海马内GSH-Px和SOD含量比空白对照组明显降低，而脂质过氧化产物MDA明显增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，Pio低剂量和高剂量组大鼠海马内GSH-Px和SOD的活性明显升高，MDA明显减少，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，其中Pio低剂量组增加显著。结论吡格列酮能够改善痴呆大鼠的学习记忆能力，其机制可能与对抗海马内的氧化应激反应有关。

Aβ25-35；吡格列酮；学习记忆能力；氧化应激

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种中枢神经退行性疾病，临床表现为进行性认知功能减退及精神障碍。典型的病理学特征为老年斑和神经原纤维缠结[1]。流行病学调查显示，截至2005年全球有3650万老年痴呆患者，到2030年这一数字将达到6500万[2]，这无疑会给社会和家庭带来了沉重的精神和经济负担。因此，开发新的抗AD药物具有重要意义。

在AD的发病中占有重要地位的淀粉样蛋白瀑布级联假说认为，淀粉样蛋白β(Amyloidβ-protein，Aβ)的沉积是AD的主要发病因素[3]。Aβ引发的免疫、炎症反应和神经毒性级联反应，能够引起广泛的神经退行性病变及神经凋亡，最终导致学习记忆能力减退和认知功能障碍。最近的研究发现，氧化应激参与AD的早期病理变化[4-5]，因此抗氧化治疗越来越受到重视。吡格列酮(Pioglitazone，Pio)是噻唑烷二酮类药，是一种过氧化物酶增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)激动剂，主要用来治疗糖尿病。研究发现，吡格列酮能抑制皮质和海马内星形胶质细胞及小胶质细胞介导的炎症反应，抑制冈田酸制备的痴呆大鼠海马内GSK-3β的表达，减少tau蛋白的过度磷酸化[6]。但是，迄今为止吡格列酮能否对抗痴呆大鼠海马内的氧化应激反应尚未见文献报道。基于以上因素，本实验旨在探讨吡格列酮对Aβ25～35诱导的痴呆大鼠学习记忆和海马内氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 动物喂养及分组 Sprague Dawley(SD)大鼠40只，体质量300～350 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。大鼠饲料条件为12 h/d光照，温度(25±2)℃，湿度60%～70%，常规饲料喂养。经过7 d的适应后，将40只大鼠随机分为空白对照组、模型组、Pio低剂量组(40mg/kg)、Pio高剂量组(80mg/kg)，每组10只。

1.2 试剂及仪器 Pio(纯度＞99.0%)购于日本Takeda公司，用二甲基亚砜(DMSO，2 g/L)(Sigma，美国，纯度＞99.9%)配制成混悬液。Aβ25～35(Sigma，美国)用生理盐水稀释成2mmol/L，放于37℃电热恒温培养箱孵育24 h，使之变成凝聚状态。谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(Maleic dialdehyde，MDA)检测试剂购于南京建成制药公司(中国)。Morris水迷宫购于中国上海欣软信息科技有限公司，Chromate酶标仪购于中国北京普天酶标仪。

1.3 动物模型的建立 将大鼠固定在脑立体定位仪上，常规备皮消毒，用手术刀切开表皮，按照脑立体定位仪图谱，找到左侧侧脑室位置钻孔(前囟后0.8mm，中线左侧旁开1.3mm，硬脑膜下3.5mm)，将Aβ25～35缓慢注入侧脑室，留针5min，空白对照组注射等量的生理盐水。注射完毕，用凡士林涂抹并缝合伤口，缓慢放回笼中。Aβ25～35注射后进行药物干预，Pio低、高剂量组用吡格列酮灌胃，剂量分别为40mg/kg、80mg/kg。空白对照组和模型组等量生理盐水灌胃。连续干预21 d。

1.4 Morris水迷宫实验 药物干预后第2天进行Morris水迷宫实验，迷宫分为四个象限，将平台放于第四象限，向迷宫内注入水，使水面高于平台1cm，水温(25±2)℃。前5 d进行定位航行实验，使其在120 s内自由游泳，记录逃避平台潜伏期。若在120 s内未找到平台，时间结束后使其在平台上停留10 s。第6天进行空间探索实验，撤掉平台，使其自由游泳，记录穿过平台次数和平台滞留时间。

1.5 GSH-Px、SOD的活性及MDA含量检测 Morris水迷宫实验完成后第2天，水合氯醛(100 g/L，用量为300mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，断头取脑，迅速分离海马组织，放入液氮中，-80℃保存，以备后用。取少量海马组织称量，按照组织：生理盐水=1:9的比例，用组织匀浆器打碎混匀，制成10%组织匀浆，用紫外分光光度计测组织匀浆的浓度，ELISA法检测海马组织内GSH-Px、SOD的活性及MDA的含量。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行实验数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示。1～5 d水迷宫实验结果采用重复测量方差分析，组间比较采用独立t检验，其余数据采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 吡格列酮对Aβ25～35诱导的痴呆大鼠学习记忆能力的影响 Morris水迷宫结果显示，定位航行实验中，模型组大鼠平均逃避平台潜伏期比空白对照组明显延长[F(3，39)=23.16，P＜0.01]，Pio治疗后AD大鼠的平均潜伏期明显缩短[低剂量组：F(3，39)=20.55，P＜0.01；高剂量组：F(3，39)=12.38，P＜0.01]。空间探索实验结果显示，模型组平台滞留时间比空白对照组明显减少[F(1，19)=13.56，P＜0.01]，经Pio治疗后，平台滞留时间明显增加[低剂量组：[F(1，19)=17.89，P＜0.01]；高剂量组：F(1，19)=13.47，P＜0.01]，其中Pio低剂量组更为明显，见表1。

表1 吡格列酮对Aβ25～35诱导的痴呆大鼠学习记忆能力的影响(±s)

表1 吡格列酮对Aβ25～35诱导的痴呆大鼠学习记忆能力的影响(±s)

注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

组别 例数 潜伏期(s)平台滞留时间(s)空白对照组模型组Pio低剂量组(40mg/kg) Pio高剂量组(80mg/kg)10101010 d122.43±2.2830.90±3.25a25.96±2.24b28.76±2.90bd24.92±0.3926.37±2.59bb13.55±1.42aa18.73±2.02aad33.42±0.3125.58±2.63a10.54±1.37b11.26±1.25bd42.50±0.2614.06±1.38a7.69±0.76b9.95±1.02bd51.56±0.189.16±1.12a4.67±0.50b9.29±1.11b1.27±0.170.51±0.03a0.75±1.03b0.68±1.70b

2.2 吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠海马内GSH-Px活性的影响 ELISA结果显示，模型组大鼠海马内GSH-Px的活性比空白对照组明显降低[F(1，19)=20.25，P＜0.01]，而Pio治疗组GSH-Px的活性比模型组增加，其中Pio低剂量组增加明显[F(1，19)=18.44，P＜0.01]，见图1。

图1 吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠海马内GSH-Px活性的影响

2.3 吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠海马内SOD活性的影响 ELISA结果显示，模型组大鼠海马内SOD的活性比空白对照组明显降低[F(1，19)=25.77，P＜0.01]，Pio治疗后SOD的活性比模型组增加，其中Pio低剂量组增加明显[F(1，19)=19.35，P＜0.01]，见图2。

图2 吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠海马内SOD活性的影响

2.4 吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠海马内MDA含量的影响 ELISA结果显示，模型组大鼠海马内MDA的含量比空白对照组明显增加[F(1，19)=13.54，P＜0.01]，Pio治疗后MDA的含量比模型组减少，其中Pio低剂量组降低更加明显[F(1，19)=10.88，P＜0.01]，见图3。

图3 吡格列酮对Aβ25～35导致的痴呆大鼠海马内MDA含量的影响

3 讨 论

研究发现，侧脑室注射Aβ毒性片段可导致大鼠学习记忆能力减退及认知功能障碍，可用于建立研究AD的动物模型[7]。本实验采用侧脑室注射Aβ25～35建立大鼠AD模型，研究Pio对Aβ25～35引起的大鼠学习记忆能力和海马内氧化应激的影响。Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠潜伏期比空白对照组明显延长，穿过平台次数和平台滞留时间也相应减少，说明大鼠的学习记忆能力下降，表明模型建立成功。

吡格列酮是一种噻唑烷二酮类药，PPARγ的激动剂，是非胰岛素依赖型糖尿病的主要治疗药物[8]。研究表明，长期使用非甾体类抗炎药物能降低患者AD的发病率，其机制除了能够抑制环氧合酶，还有可能与激活PPARγ受体有关[9]。研究表明，PPARγ激动剂可抑制神经元内诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase，iNOS)的表达[10]。iNOS表达增加可使一氧化氮的产生增多，导致脑内的氧化应激增强，引起神经元死亡[11]。此外，新的病因学假说认为AD是一种“Ⅲ型糖尿病”，即发生在大脑内的糖尿病，以糖/能量代谢紊乱为主要特征，进而影响线粒体功能和神经突触的可塑性。

氧化应激反应参与AD的早期病理变化[12-13]。自由基是导致神经元凋亡和其他不可逆性病变的主要因素。由于大脑内还原性谷胱甘肽含量低[14]、神经元细胞膜含有大量多元不饱和脂肪酸[15]以及大脑的正常代谢需要大量氧气[16]，大脑极易受到自由基的攻击[17-18]。氧化应激假说可以解释AD的多元化的特征及病因。故本课题采用Aβ25～35诱导的痴呆大鼠研究Pio对痴呆鼠海马内氧化应激的反应。ELISA结果显示，侧脑室注射Aβ25～35致使大鼠海马内氧化应激反应增强，酶性抗氧化剂GSH-Px和SOD的活性降低，脂质过氧化产物MDA含量增加，而Pio治疗组海马内酶性抗氧化剂活性降低，脂质过氧化产物减少，表明吡格列酮能对抗痴呆大鼠海马内的氧化应激反应。

本实验研究证实了Pio对AD的治疗作用及其可能的机制，为进一步临床试验提供了依据。此外，目前的治疗药物只能缓解AD的临床症状，延缓AD的进展，但无法将其彻底治愈。Pio对AD是否有预防作用，其他PPARγ激动剂对AD是否也有提高学习记忆的能力，我们将在后续的实验中进行研究。

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Effects of pioglitazone on learning and memory abilities and oxidative stress in the hippocampus of rats with Aβ25～35-induced Alzheimer's disease.

FAN You-zhong1,ZHAO Shan-shan2.1.Department of Internal Medicine, Zhen'an County Hospital,Zhen'an711500,Shaanxi,CHINA;2.Department of Human Anatomy and Histology,School of Basic Medical Sciences,Xi'an Jiaotong University,Xi'an710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo study the effects of pioglitazone(Pio)on learning and memory abilities and oxidative stress in the hippocampus of rats with Aβ25～35-induced Alzheimer's disease.MethodsForty rats were randomly divided into four groups:control group,model group,low-dose Pio group and high-dose Pio group,with10 rats in each group.And the rats in low-dose Pio group and high-dose Pio group were administrated with Pio of40mg/kg and80mg/kg,respectively,for21 days.The control group and model group were administrated with the same volume of normal saline.Morris water maze test was used to test the learning and memory abilities of the rats.During the first5 days,orientation navigation test was carried out,followed by the spatial probe test on the sixth day.After the behavior test,the rats were sacrificed for preparing tissue homogenate.And ELISA was used to measure glutathione peroxidase (GSH-Px)and superoxide dismutase(SOD)activities,as well as the level of maleic dialdehyde(MDA).ResultsMorris water maze test showed that the escape latency was significantly prolonged in rats of model group compared with control group,while the number of crossing the platform and time spent on the platform were reduced(P＜0.05).After administration of Pio,the escape latency was significantly decreased,while the number of crossing the platform andtime spent on the platform were increased significantly,particularly in low-dose Pio group,as compared with model group(P＜0.05).ELISA showed that compared with the control group,the activities of GSH-Px and SOD were decreased but the level of MDA was increased in the AD rats of model group(P＜0.05).Pio significantly increased the activities of GSH-Px and SOD but decreased the level of MDA in the AD rats,especially in low-dose Pio group(P＜0.05).ConclusionPio can improve the learning and memory abilities of AD rats,the mechanism of which may be related to attenuating oxidative stress in the hippocampus.

Aβ25～35;Pioglitazone;Learning and memory abilities;Oxidative stress

R-332

A

1003—6350（2015）22—3284—04

2015-06-27)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.22.1193

赵珊珊。E-mail：shanshanzhao_1988@163.com