利用正交试验筛选阿魏酸等四种药物干预在体大鼠MIRI凋亡最佳组合

高宇勤，郝霁萍，贺少辉，赵国平

（1.西安市第九医院心血管内科，陕西 西安710054；（2.暨南大学医学院中西医结合科，广东 广州510632）

·论 著·

利用正交试验筛选阿魏酸等四种药物干预在体大鼠MIRI凋亡最佳组合

高宇勤1，郝霁萍1，贺少辉1，赵国平2

（1.西安市第九医院心血管内科，陕西 西安710054；（2.暨南大学医学院中西医结合科，广东 广州510632）

目的利用正交实验方法探究阿魏酸、芍药苷、甘草酸及肉桂酸四种药物组合预处理对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的心肌细胞凋亡的干预作用，并寻找最佳药物组合。方法本实验采用了结扎SD大鼠心脏冠状动脉前降支(LA)的方法建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型；采用L16(44)正交实验设计和0.5%Evan's蓝灌注心肌及1%TTC磷酸缓冲液孵育心肌观察心肌坏死；利用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果比较各因素的极差发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸对大鼠MIRI模型心肌梗死面积影响的顺序是：芍药苷＞甘草酸＞阿魏酸＞肉桂酸；阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸对大鼠MIRI模型的心肌细胞凋亡指数影响的顺序是：芍药苷＞甘草酸＞肉桂酸＞阿魏酸；阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸四药混合干预大鼠MIRI心肌细胞凋亡指数最佳选择方案是：芍药苷(高剂量，100mg/kg)、甘草酸(高剂量，100mg/kg)、阿魏酸(中剂量，300mg/kg)、肉桂酸(中剂量，200mg/kg)。结论芍药苷(高剂量，100mg/kg)、甘草酸(高剂量，100mg/kg)、阿魏酸(中剂量，300mg/kg)、肉桂酸（中剂量，200mg/kg)组合是降低心肌细胞凋亡、减少心肌梗死面积的最佳组合。

正交试验；心肌缺血再灌注损伤；芍药苷；甘草酸；阿魏酸；肉桂酸

缺血再灌注损伤(MIRI)是心肌缺血再灌注后出现的一种病理生理过程，通过预防缺血再灌注损伤可以显著减少缺血心肌恢复血运后损伤，有利于改善预后。目前发现模拟性药物预处理及后处理确实具有保护组织缺血再灌注损伤的作用[1]。芍药苷、阿魏酸、肉桂酸、甘草酸等四种药物是天然药物中提取的成分，有研究提示上述四种药物具有减轻心肌缺血再灌注损伤的作用[2-3]，但是这四种药物对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的干预是否具有优劣性差别，以及四种药物如何组合才能发挥最大效果，目前尚无相关研究。正交实验是一种筛选最佳药物组合的重要研究方法，其根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。正交试验设计是分析因式设计的主要方法，通过此种实验设计可以找出多因素中的最佳组合。本实验利用在体大鼠冠状动脉前降支(LAD)结扎术模型，采用正交实验设计方法，探讨芍药苷、阿魏酸、肉桂酸、甘草酸四种活性成分预处理对心肌保护作用的优劣性及最佳组合，为寻找治疗MIRI最佳的鸡尾酒疗法提供初步的实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 芍药苷、阿魏酸、甘草酸及肉桂酸购于南京泽朗医药科技有限公司(批号分别为ZL20090409SYG、ZL20090425AWS、ZL20090301GCS、ZL2008009RGS)，TNUEL试剂盒(KGA7032)购于凯基生物有限公司。

1.2 动物模型的建立 SPF级雄性SD(128只)大鼠，体重280～400 g，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCXK(粤)2008-0002，将大鼠称重，注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，固定大鼠仰卧于手术台，颈部及胸部备皮消毒，颈部皮肤被纵形剪开1.5～2cm，分离皮下组织及肌肉，显露气管，行气管插管，接呼吸机，调整呼吸频率60次/min、通气量20ml/kg。纵形剪开第三胸骨左缘胸部皮肤约4cm，钝性分离，显露胸膜，撑开肋骨，撕破心包，显露心脏，确定缝扎位置(肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2mm，前降支LAD近端位置)。用0号线，叠一个0.8～1mm的凹槽硅胶管，出针打结结扎LAD，缺血30min，松开结扎，复灌2 h。模型复制的可靠性ECGⅡ导联ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功。本实验建模总共有12只SD大鼠因为麻醉和手术原因死亡，死亡率为9.3%。

1.3 分组及给药方案 实验选用L16(44)正交实验表，每味药为一种因子，其代号随机选定，分别编为A甘草酸、B阿魏酸、C芍药苷、D肉桂酸四种因子，取“不用药”、“低剂量”、“中剂量”、“高剂量”四水平，分别设为1为不用药，2为低剂量组，3为中剂量组，4为高剂量组四种水平。甘草酸：灌胃剂量分别为25mg/kg(低剂量)、50mg/kg(中剂量)、100mg/kg(高剂量)；芍药苷：灌胃剂量剂量分别为25mg/kg(低剂量)、50mg/kg(中剂量)、100mg/kg(高剂量)；肉桂酸：灌胃剂量分别为100mg/kg(低剂量)、200mg/kg (中剂量)、400mg/kg(高剂量)；阿魏酸：灌胃剂量分别为200mg/kg(低剂量)、300mg/kg(中剂量)、400mg/kg (高剂量)；以上剂量都是全天剂量，灌胃1次/d，灌4 d，最后一次于手术前30min给予，见表1和表2。

表1 正交实验设计因素及水平表(mg/kg)

表2 正交实验L16(44)设计表

1.4 心肌梗死面积测定 实验终点时暴露心脏，原位结扎左冠状动脉主干，经主动脉逆行灌注(压力为80mmHg，1mmHg=0.133 kPa)0.5%Evan's蓝2～3ml，立即取心脏，以预冷生理盐水冲洗残余血液，将左室与其他心肌组织分离，快速置于液氮中，取出冷冻心脏，沿左室长轴方向连续环切，每片2～3mm，正常心肌组织为蓝色，缺血区心肌组织为粉色，然后将无蓝染缺血心肌置入1%TTC磷酸缓冲液(pH7.4)中37℃孵育20min，此时坏死区呈灰白色，非坏死区呈深红色，其后将坏死区和非坏死区分离，滤纸吸干，置于电子天平上称重。梗死面积以坏死心肌重量与缺血心肌重量(坏死区与非坏死区之和)之比表示。

1.5 心肌TUNEL凋亡原位检测及步骤 再灌注结束迅速剪下心脏，置于冰磷酸盐缓冲液(PBS)中洗净残血，分离左心室前壁缺血边缘区，于10%的中性甲醛固定12 h，经脱水、脱蜡、水合等过程制作成石蜡切片。按照TUNEL试剂盒方法操作(具体步骤略)。阳性细胞核呈棕黄色，阴性细胞核呈蓝色。每张切片于缺血部位随机选取8个高倍视野(×400倍)，分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数并进行汇总，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数=凋亡细胞数/心肌细胞总数。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件，计量资料数据以均数±标准差(±s)表示。16组之间进行正交设计的方差分析，同时应用正交实验设计的直观分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌梗死面积测定结果 本实验利用TTC磷酸缓冲液孵育(TTC为2，3，5氧化三苯基四氮唑，是脂溶性光敏感复合物，用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗死)无蓝染的缺血心肌，坏死区呈灰白色，非坏死区呈深红色。通过表3分析，比较各因素的极差发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型心肌梗死面积影响的顺序为芍药苷＞甘草酸＞阿魏酸＞肉桂酸。

组别1234甘草酸(A)阿魏酸(B)芍药苷(C） 肉桂酸(D)12345678910111213141516 K1 K2 K3 K4 Rj1342243141223341134243241331142211113244434232321342111322434234心肌梗死面积(%)0.30±0.070.13±0.030.13±0.100.27±0.030.17±0.160.07±0.040.10±0.060.11±0.090.07±0.030.10±0.030.10±0.010.12±0.020.13±0.070.11±0.040.14±0.050.13±0.040.160.160.120.100.060.150.160.100.130.060.210.110.130.090.120.160.140.120.120.04

2.2 心肌细胞凋亡指数测定结果 本实验利用生物素(Biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'-OH末端，并可与连接了辣根过氧化酶的链霉亲和素特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确的定位凋亡细胞，该原理可检测心肌细胞凋亡。通过表4分析，比较各因素的极差发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸对大鼠MIRI模型心肌细胞凋亡指数影响的顺序为芍药苷＞甘草酸＞肉桂酸＞阿魏酸，通过方差分析(以α＜0.05为差异有统计学意义)发现芍药苷、甘草酸、肉桂酸、阿魏酸差异均具有统计学意义(见表5)，其P值分别为0.000、0.000、0.000、0.041。根据心肌细胞凋亡指数实验数据越小越有利，比较各因素不同水平的综合平均值，再结合方差分析结果发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸四药混合干预大鼠心肌缺血再灌注损伤模型心肌细胞凋亡指数的最佳选择方案为芍药苷(高剂量，100mg/kg)、甘草酸(高剂量，100mg/kg)、阿魏酸(中剂量，300mg/ kg)、肉桂酸(中剂量，200mg/kg)。

表4 四种药物干预大鼠MIRI心肌细胞凋亡指数正交实验L16(44)直观分析(±s)

表4 四种药物干预大鼠MIRI心肌细胞凋亡指数正交实验L16(44)直观分析(±s)

组别1234甘草酸(A)阿魏酸(B)芍药苷(C)肉桂酸(D)凋亡指数(%)12345678910111213141516 K1 K2 K3 K4 Rj13422431412233411342432413311422111132444342323213421113224342340.39±0.030.30±0.010.31±0.010.38±0.020.33±0.030.24±0.020.22±0.040.26±0.040.19±0.010.31±0.020.24±0.030.29±0.010.33±0.050.20±0.010.20±0.010.35±0.040.330.310.260.240.090.300.290.270.280.030.350.270.300.230.120.300.270.260.310.05

表5 正交实验16组心肌细胞凋亡指数方差分析结果

3 讨 论

有实验研究发现，细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发病机制的重要环节之一，在人类心肌梗死尸检中也发现，梗死灶收缩带有明显的细胞凋亡，和实验室结果相符。因此细胞凋亡与心肌短暂缺血后再灌注损伤程度密切相关[4-5]，通过降低心肌细胞凋亡可以明显减轻缺血再灌注损伤的程度。研究发现芍药苷、甘草酸、肉桂酸、阿魏酸具有减轻心肌缺血再灌注损伤的作用[2-3]，但是上述四种药物对心肌缺血再灌注损伤时出现的心肌细胞凋亡干预的优劣性以及它们是否可以协同增加抗凋亡作用和有无最佳鸡尾酒组合，目前尚无研究，本实验就是因此而设计。

正交实验根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，是分析因式设计的主要方法，通过此种实验设计可以找出多因素中的最佳组合，特别适合多种因素交互作用的研究，本实验就是利用此设计的优点来探讨中药多种成份的交互作用。

本实验选用L16(44)正交实验表分组，通过比较各因素的极差发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸减少大鼠缺血再灌注损伤模型的心肌梗死面积作用强弱的顺序为芍药苷＞甘草酸＞阿魏酸＞肉桂酸。通过分析凋亡指数各因素的极差发现，上述四种药物减轻心肌细胞凋亡的强弱顺序也是芍药苷＞甘草酸＞肉桂酸＞阿魏酸，说明上述四种药物减少心肌梗死面积的效应与抗凋亡作用具有明显相关性。根据心肌细胞凋亡指数实验数据越小越有利，比较各因素不同水平的综合平均值，再结合方差分析发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸四药混合干预大鼠心肌缺血再灌注损伤模型心肌细胞凋亡指数的最佳选择方案是芍药苷(高剂量，100mg/kg)甘草酸(高剂量，100mg/kg)阿魏酸(中剂量，300mg/kg)肉桂酸(中剂量，200mg/kg)。此最佳组合可能是一种有效的抗心肌细胞凋亡的鸡尾酒组合。至于该组合机制的多靶点可能性，需要进一步研究明确。

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Screening of optimum drug combination of ferulic acid,paeoniflorin,glycyrrhizic acid and cinnamic acid for anti-cardiomyocyte apoptosis in the myocardial ischemia reperfusion injury of rats by orthogonal design in vivo.

GAO Yu-qin1,HAO Ji-ping1,HE Shao-hui1,ZHAO Guo-ping2.1.Department of Cardiovascular Medicine,Ninth Hospital of Xi'an,Xi'an710054,Shaanxi,CHINA;2.Department of Integrative Medicine,School of Medicine,Jinan University,Guangzhou510632,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of pretreatment with drug combinations of ferulic acid,and paeoniflorin,glycyrrhizic acid and cinnamic acid on cardiomyocyte apoptosis in myocardial ischemia reperfusion injury in rats,and to find the best drug combination.MethodsMyocardial ischemia reperfusion injury models were established by ligation of left descending coronary artery and reperfusion in SD rats.L16(44)orthogonal design,perfusion of0.5%Evan's blue and incubation of1%TTC were applied to observe myocardial infarction.Apoptotic index were detected by TUNEL.ResultsThe four drugs'effect on reducing infarct size of myocardium after ischemia/reperfusion from high to low was peoniflorin＞glycyrrhizic acid＞ferulic acid＞cinnamic acid,and the effect on reducing apoptotic index of myocardium after ischemia/reperfusion from high to low was peoniflorin＞glycyrrhizic acid＞cinnamic acid＞ferulic acid.The optimum drug combination was peoniflorin(100mg/kg),glycyrrhizic acid(100mg/kg),cinnamic acid(200mg/kg)and ferulic acid(300mg/kg).ConclusionThe drug combination of paeoniflorin(high dose,100mg/kg),glycyrrhizic acid(high dose,100mg/kg),ferulic acid(medium dose,300mg/kg)and cinnamic acid(medium dose,200mg/kg)is the optimum combination for lowering the myocardial apoptosis and reducing myocardial infarction area.

Orthogonal design;Myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI);Paeoniflorin;Glycyrrhizic acid;Ferulic acid;Cinnamic acid

R-332

A

1003—6350（2015）22—3277—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.22.1191

2015-08-01)

国家自然科学基金(编号：81173189)；西安市卫生局科技项目及西安市科技项目(编号：SF1416)

郝霁萍。E-mail：470837625@qq.com