地塞米松对早期脂多糖大鼠肝组织髓样分化蛋白2及核因子-κB表达的影响

雷贤英，李雨昕，雷贤蓉，甘辞海，胡丽蓉，薛钰婷

(1.泸州医学院附属医院ICU，四川 泸州 646000；2.泸州医学院护理学院，四川 泸州 646000；3.泸州医学院附属医院供应室，四川 泸州 646000)

·论 著·

地塞米松对早期脂多糖大鼠肝组织髓样分化蛋白2及核因子-κB表达的影响

雷贤英1，李雨昕2，雷贤蓉3，甘辞海1，胡丽蓉1，薛钰婷1

(1.泸州医学院附属医院ICU，四川 泸州 646000；2.泸州医学院护理学院，四川 泸州 646000；3.泸州医学院附属医院供应室，四川 泸州 646000)

目的观察地塞米松对脂多糖大鼠早期急性肝损伤时肝组织髓样分化蛋白2(MD-2)基因及核因子-κB(NF-κB)蛋白表达的影响。方法15只雄性SD大鼠被随机分为正常组、脂多糖组和治疗组（脂多糖+地塞米松组），每组各5只。自大鼠尾静脉穿刺置留置针以备给药，正常组自大鼠尾静脉注射生理盐水10ml；脂多糖组静脉注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)；治疗组静脉注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)和地塞米松0.1mg/kg。所有大鼠均于注射后1 h被处死，抽取左心室血行生化检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。剪取部分肝右叶制成肝组织匀浆液(保存于-20℃条件下以备用)，以检测肝组织MD-2基因，另取部分肝组织检测NF-κB蛋白的表达水平。结果(1)正常组大鼠转氨酶值波动于正常范围，脂多糖组大鼠ALT、AST明显增高，与脂多糖组比较，治疗组转氨酶值明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；(2)正常的肝组织中可见少量MD-2基因、NF-κB蛋白表达；与正常组比较，脂多糖组和治疗组肝组织MD-2基因及NF-κB蛋白的表达水平均明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但治疗组MD-2基因及NF-κB蛋白的表达较脂多糖组明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论早期脂多糖大鼠发生急性肝损伤时，地塞米松对其有明显的治疗作用，其治疗机制可能与MD-2基因和NF-κB蛋白表达水平的减少有关。

脂多糖；髓样分化蛋白2；核因子-κB(NF-κB)；急性肝损伤；地塞米松

脓毒症因其高发病率、高死亡率严重威胁了危重患者的生命，是导致ICU重危患者死亡的首位原因。全身炎症反应综合征是脓毒症的主要病理生理机制，当严重感染引起大量炎性介质释放引发脓毒症级联反应时，网状内皮系统被持续激活，处于炎症上游的调控蛋白髓样分化蛋白2(Myeloid differentiation protein-2，MD-2)和大量炎症反应基因表达的控制点核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)均大量表达出来，最终导致机体发生多器官功能损伤甚至衰竭。本实验用地塞米松进行干预，研究其对早期脂多糖大鼠MD-2基因及NF-κB蛋白表达的影响，探讨地塞米松在脓毒症救治中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料 地塞米松注射液(天津药业焦作有限公司，5mg/ml，批号H41020036)；脂多糖(血清型O111和B4，购于Sigma公司)用5%GS配制。LATaqwith GC Buffer PCR试剂盒、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver3.0试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物和分组 雄性、健康SD大鼠15只(体重200～250 g)均购自泸州医学院动物实验中心。15只大鼠按照完全随机化原则被分为正常组、脂多糖组以及治疗组(脂多糖+地塞米松组)，每组各5只。

1.2.2 建立动物模型和取材 自清醒大鼠尾静脉穿刺放置留置针，用肝素水封管后固定导管以备给药。随后自留置针导管注射药物：正常组注射生理盐水10ml；脂多糖组注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)；治疗组注射脂多糖10mg/kg(10min以上注射完)和地塞米松0.1mg/kg。所有大鼠均在注射后1 h被处死，抽取左心室血行生化检测。剪取部分肝右叶制成肝组织匀浆液(保存于-20℃条件下以备用)；另取部分肝组织用甲醛固定。

1.2.3 MD-2 mRNA表达的检测 用逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)方法进行检测：取保存于-20℃条件下的肝组织匀浆液，将0.5 μg RNA进行反转录后，采用PCR仪分析基因表达。引物设计用Olig 6.0和Primer 5.0软件(见表1)，用BLAST检测引物特异性，根据 GeneBank中 MD-2(ACCESSION：AY963291)、β-actin(ACCESSION：BC002409)、GAPDH(ACCESSION：NM_002046)序列，用凝胶定量分析软件Gel-Pro analyzer 4.0来检测RT-PCR扩增产物电泳条带的OD值，即光密度值。

表1 MD-2基因

1.2.4 肝组织NF-κB蛋白表达水平的检测 将甲醛固定后的肝组织标本石蜡包埋后切成5 μm厚切片。免疫组化法采用EnVision二步法，石蜡切片脱蜡至水后，在3%H2O2中进行室温孵育，磷酸盐缓冲液(PBS)轻冼3遍，滴加正常山羊血清工作液，再在37℃条件下孵育1 h，去掉血清，滴加1：100稀释的一抗(兔抗人)，在4℃下过夜后洗涤，滴加酶二抗聚合物，然后室温下孵育40min，最后洗涤DAB显色5min，终止显色后用自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水封片。用日本OLYMPUS生物显微镜采集图像进行结果判读，在高倍镜下(×400)选取不少于5个不重叠的视野，对图像进行分析(用Lmage-Pro Plus软件)，计算阳性表达面积占待测总面积的百分比，求和后得到平均值，即可得出大鼠肝组织NF-κB蛋白的表达值。

1.2.5 转氨酶的检测 将采集的各组大鼠左心室血行生化检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用随机分组设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠转氨酶比较 正常组大鼠ALT、AST值波动于正常范围，脂多糖组大鼠ALT、AST值明显增高，与脂多糖组比较，治疗组转氨酶值明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠转氨酶比较(U/L，±s)

表2 各组大鼠转氨酶比较(U/L，±s)

注：与正常组比较，aP＜0.05；与脂多糖组比较，bP＜0.05。

组别ALT例数AST正常组脂多糖组治疗组F值P值37.4±12.7 102.3±20.9a79.3±16.8ab18.462 0.000 34.6±17.5 103.5±19.7a80.4±16.25ab19.217 0.000 555

2.2 各组大鼠MD-2基因、NF-κB蛋白表达情况 正常的肝组织中可见少量MD-2基因、NF-κB蛋白表达；与正常组比较，脂多糖组和治疗组肝组织MD-2基因和NF-κB蛋白的表达水平均明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但治疗组MD-2基因及NF-κB蛋白的表达较脂多糖组明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠MD-2基因及NF-κB蛋白阳性表达水平比较(%，±s)

表3 各组大鼠MD-2基因及NF-κB蛋白阳性表达水平比较(%，±s)

注：与正常组比较，aP＜0.05；与脂多糖组比较，bP＜0.05。

组别 例数MD-2基因NF-κB正常组脂多糖组治疗组F值P值555 0.211±0.051 10.721±0.082a0.574±0.091ab57.616 0.000 0.350±0.079 1.232±0.104a0.914±0.074ab132.427 0.000

3 讨论

MD-2是一种天然的对免疫具有调节作用的蛋白，当细菌感染机体时，MD-2 mRNA的表达上调，从而引发炎症反应[1]。MD-2具有相当大的生物学功能价值，在炎症、感染、免疫等病理生理过程中作用尤为明显[2]，在识别配体和转导信号的过程中起着非常重要的作用。MD-2是TLR4介导的LPS信号转导的一种索状分化辅助蛋白，TLR4是脂多糖(LPS)跨膜信号转导的主要受体，它们最终形成LPS-TLR4-MD-2复合物受体[3]，共同完成介导脂多糖(LPS)炎症信号的跨膜转导。同时，MD-2能增强细胞上TLR4对LPS的反应,最终引起机体NF-κB的激活，启动机体大量细胞因子和炎症介质的转录和释放。作为炎症反应枢纽点的NF-κB，与炎症因子互为因果，导致机体促炎与抗炎失衡，最终引起大量TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症因子释放和表达以及炎症瀑布式级联反应的发生[4-5]，引起全身炎症反应综合征。可见，MD-2和NF-κB在这个炎症级联反应过程中起着重要作用。随着对MD-2和NF-κB在结构和功能方面的深入研究，MD-2和NF-κB很可能作为全身炎症综合征治疗中的“新靶点”，成为研究的“热点”。

NF-κB在全身炎症反应中起着重要作用，它参与了炎性细胞因子如TNF-α等的基因转录过程，是重要的细胞内核转录因子。在一般情况下，NF-κB与胞浆中的抑制蛋白IκB结合，形成一种非激活状态，当脂多糖、TNF-α等炎症分子刺激细胞时，IκB磷酸化后被降解，NF-κB与IκB分离后迅速活化、再磷酸化，通过核孔复合体受体，活化的NF-κB进入细胞核，结合细胞核上的目标基因结合位点，开始了一系列启动和调控炎症细胞因子基因表达的过程，引起全身爆发性的炎症反应，导致肝脏和其他器官的损伤。在脓毒症患者中，NF-κB的活化起着关键作用[6-7]，这与本实验的研究结果一致。本实验采用脂多糖复制脓毒症大鼠模型，实验结果显示脂多糖组肝组织MD-2 mRNA和NF-κB蛋白表达水平明显升高，脂多糖组大鼠肝功能损害重，转氨酶上升明显。

地塞米松是一种重要的类固醇激素，属于糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)，是由肾上腺皮质分泌的，它在细胞的生长、发育、分化和自我稳态调节及细胞存活等方面扮演着重要的角色。治疗剂量的糖皮质激素能够降低脱颗粒反应，减少组胺和花生四烯酸的释放，具有稳定肥大细胞膜、溶酶体膜、保护血管内皮细胞等作用，在脓毒症时可以起到保护脏器的作用。在早期脓毒症大鼠急性肺损伤的模型中，地塞米松治疗组肺水通道蛋白1基因表达上调，肺湿、干重比值降低，血气分析参数(包括PaO2、pH值等)均有明显的改善[8]。同时，在地塞米松和异丙酚在早期脓毒症大鼠的联合应用中，也证实地塞米松和异丙酚具有协同抗炎作用，对抗炎因子IL-10的表达有上调作用，对促炎因子TNF-α等的表达具有明显的下调作用[9]。一系列研究均显示，在严重感染的脓毒症模型中使用糖皮质激素可在呼吸生理、抗炎及脏器保护等方面均显著获益。本课题在以上研究基础上，用脂多糖复制脓毒症大鼠急性肝损伤模型，就地塞米松在脓毒症时的脏器保护作用机制作了进一步深入的研究。实验结果表明，地塞米松对早期脂多糖大鼠急性肝损伤有脏器保护作用，治疗剂量的地塞米松能够下调肝组织MD-2和NF-κB的表达水平，降低大鼠转氨酶。MD-2基因和NF-κB蛋白的下调可能是地塞米松在早期脂多糖大鼠急性肝损伤时脏器保护和抗炎的重要机理所在。

综上所述，随着地塞米松治疗脓毒症机理的逐渐深入，脓毒症的传统治疗除了早期集束化治疗、积极抗感染、抗休克、纠正内环境紊乱、稳定循环等处理外，结合本研究结论，应用治疗剂量的地塞米松进行脏器保护也很有必要，值得作更进一步的临床观察，为改善脓毒症患者的预后作更多的努力。

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[8]雷贤英,甘辞海,钟 庆,等.地塞米松对早期脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用研究[J].现代医药卫生,2012,28(3)：321-322.

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Effect of dexamethasone on expression of MD-2 genes and nuclear factor-κB in liver tissue at the early stage of LPS-induced rats.

LEI Xian-ying1,LI Yu-xin2,LEI Xian-rong3,GAN Ci-hai1,HU Li-rong1,XU Yu-ting1.1.Intensive Care Unit,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA;2.College of Nursing, Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA;3.Sterilization and Supply Room,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of dexamethasone on expression of myeloid differentiation protein-2(MD-2)genes and nuclear factor-κB(NF-κB)in liver tissue at the early stage of lipopolysaccharide(LPS)-induced rats.MethodsFifteen male SD rats were randomly divided into normal group,LPS group and treatment group(LPS+dexamethasone group),with 5 rats in each group.The rats were punctured catheter from tail vein to prepare for the administration.Normal group was injected with 10ml saline,LPS group was injected with LPS(10mg/kg) for more than 10min,and the treatment group was injected with LPS(10mg/kg,for more than 10min)and dexamethasone(0.1mg/kg).The rats were killed at 1 h after injection.The blood from the left ventricle was tested by biochemical detection for alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST).A part of the right lobe of liver tissue were extracted to store at-20℃in order to detect the expressions of MD-2 gene,and another part of the liver tissue were extracted to detect the level of NF-κB protein.Results(1)ALT and AST levels of the normal group were within the normal range,and the ALT and AST levels in LPS group were significantly increased.Compared with LPS group,the levels in treatment group were significantly decreased,with statistically significant difference between the two groups(P＜0.05).(2)The expressions of MD-2 gene and NF-κB protein were revealed low in the normal group,while the expressions in LPS group and treatment group were relatively high,showing statistically significant difference with the normal group(P＜0.05).The expressions in the treatment group were significantly decreased compared with LPS group(P＜0.05).ConclusionDexamethasone has significant clinical effects on acute liver injury at the early stage of LPS-induced rats.The mechanism may be associated with decreased expression level of MD-2 gene and NF-κB protein.

Lipopolysaccharide(LPS);Myeloid differentiation protein-2(MD-2);Nuclear factor-κB(NF-κB); Acute liver injury;Dexamethasone

R-332

A

1003—6350（2015）21—3121—03

2015-06-18)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1136

四川省教育厅自然科学重点项目[川教函(2008)760号：09027]；泸州医学院青年基金资助项目(编号：泸医院科[2009]1号-09008)

甘辞海。E-mail：ganyang130@sina.com