重组日本七鳃鳗毒素蛋白rLj-RGD3 对凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护作用

吕 莉，王继红，张 艳，孙晓红，肖 蓉，李庆伟* (.辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所，辽宁 大连 6029;2.大连医科大学药学院药理教研室，辽宁 大连 6044;.中国人民解放军第20 医院，辽宁 大连 602)

重组日本七鳃鳗RGD 毒素蛋白rLj－RGD3是源自日本七鳃鳗口腔腺的可溶性RGD 毒素蛋白，分子量为13 600，由118 个氨基酸组成，其一级结构中含有3 个RGD 模体。前期研究表明，rLj－RGD3 符合RGD 毒素蛋白的特性，凭借其分子中含有的3 个RGD(Arg－Gly－Asp)模体而具有抗血小板聚集功能［1－2］。本研究旨在研究其保护凝血酶诱发的小鼠肺栓塞死亡作用并与肝素比较其出血倾向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

重组日本七鳃鳗RGD 毒素蛋白rLj－RGD3，由辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所实验室提供;肝素钠(Heparin)，北京奥博星生物技术有限责任公司产品;牛凝血酶，沈阳拜英生物技术有限公司产品。

昆明种小鼠，雄性，18 ～22 g，由大连医科大学动物中心提供，清洁级，许可证号SCXK(辽)2008－0002，饲养温度(20 ±1)℃，湿度30% ～50%。

1.2 rLj－RGD3 对凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护作用

按文献［3］方法，稍作调整确定凝血酶攻击剂量为2 500 IU/kg。取小鼠70 只，随机分为7 组:NS 组，rLj－RGD3 0.13、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg 组以及阳性对照药Heparin 200.0 IU/kg 组。给药组小鼠腹腔注射(i.p)不同受试药物，NS 组小鼠i.p 等容量NS(0.02 mL/g)，药后10 min 自尾静脉注射凝血酶2 500 IU/kg进行攻击，观察并记录15 min 内小鼠是否死亡，以15 min 内未死亡小鼠占本组受试鼠总数的百分数，作为rLj－RGD3 对抗凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护百分率，并计算rLj－RGD3 对抗凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护作用的ED50。

1.3 等效剂量肝素与rLj－RGD3 对小鼠出血时间的影响

由1.2 项下结果计算得，对凝血酶诱发的小鼠肺栓塞死亡的保护百分率为40% 的肝素剂量为200.0 IU/kg，rLj－RGD3 剂量为0.30 mg/kg，实验采用此等效剂量，比较二者的出血不良反应倾向。取小鼠30 只，随机分为3 组:肝素200 IU/kg 组、rLj－RGD3 0.30 mg/kg 组及NS 空白对照组。小鼠腹腔注射不同受试药物后10 min，距尾尖2.0 mm 切断，每隔30 s用滤纸轻拭尾尖断端，记录自断尾开始至不再能吸到血液为止的时间，即出血时间(BT)［4］，以空白对照组为基准，计算BT 延长%。

2 结 果

2.1 rLj－RGD3 对凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护作用

结果如图1 所示，NS 组小鼠存活数为0/10，而rLj－RGD3 由低剂量到高剂量小鼠存活数分别为2/10、3/10、6/10、7/10 和9/10，保护百分率分别为20%、30%、60%、70%和90%，呈剂量依赖性。阳性对照药Heparin 200.0 IU/kg 组小鼠的存活数为4/10，保护百分率为40%(P ＜0.01)。

将保护百分率换算成概率单位(Y)与对数剂量(X)进行线性回归，得回归方程Y = 1.754 0X +5.666 0(r = 0.988 7)，计算得rLj－RGD3 对抗凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护作用的ED50为0.42 mg/kg。

图1 响腹腔注射不同剂量rLj-RGD3 对凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护作用

2.2 等效剂量肝素与rLj-RGD3 对小鼠尾BT 影响

由表1 可知，与NS 组相比，200.0 IU/kg 肝素和0.30 mg/kg rLj－RGD3 BT 延长%分别为323.8%和78.1%(P ＜0.01)，rLj－RGD3 组BT 延长%是等效剂量肝素组的24.1%(P ＜0.01)。

表1 腹腔注射等效剂量rLj-RGD3 和肝素对小鼠尾BT的影响(±s，n=10)

表1 腹腔注射等效剂量rLj-RGD3 和肝素对小鼠尾BT的影响(±s，n=10)

与NS 组比较，* P ＜0.01;与Heparin 组相比，#P ＜0.01

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3 讨 论

本实验以凝血酶攻击复制小鼠肺栓塞模型，是于静脉内注入凝血酶激活凝血系统及血小板，形成血栓，栓塞于肺部，造成小鼠循环衰竭、缺氧甚至死亡，形成的栓子主要成分为纤维蛋白和血小板，因此该模型也可作为研究抗栓药物的经典动物模型［3］。研究结果表明，rLj－RGD3 呈剂量依赖性地保护小鼠免受凝血酶诱发肺栓塞死亡，对凝血酶攻击诱发的小鼠肺栓塞具有抑制作用。RGD 毒素蛋白可通过其分子中的RGD 模体专一性地与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa结合，竞争性地拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止血小板的活化和GPⅡb/Ⅲa 受体构象的改变，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，产生抗血栓形成作用［5］。因此，受试rLj－RGD3 因其含有3 个RGD 模体而具有抗血小板聚集的生物学活性［2］，可抑制凝血酶诱发的小鼠肺栓塞形成。

肝素与rLj－RGD3 均具有抗栓活性，使用剂量过大可能造成出血等不良反应。本研究表明，等效(对凝血酶诱发小鼠肺栓塞死亡的保护%同为40%)剂量的肝素与rLj－RGD3 使小鼠BT 分别延长323.8%和78.1%，rLj－RGD3 延长BT 作用是肝素的24.1%(P ＜0.01)，相当于肝素出血作用的1/4。说明rLj－RGD3 的出血不良反应明显低于肝素，作用更安全，具有良好开发前景。

［1］ Careya CM，Bueno R，Gutierrez DA，et al.Recombinant rubistatin (r－Rub)，an MVD disintegrin，inhibits cell migration and proliferation，and is a strong apoptotic inducer of the human melanoma cell line SK－Mel－28［J］.Toxicon，2012，59(2):241－248.

［2］ Wang Jihong，Han Xiaoxi，Yang H，et al.A novel RGD－toxin protein，Lj－RGD3，from the buccal gland secretion of Lampetra japonica impacts diverse biological activities［J］.Biochimie，2010，92(10):1387－1396.

［3］ Paul W，Gresele P，Momi S，et al.The effect of defibrotide on thromboembolism in the pulmonary vasculature of mice and rabbits and in the cerebral vasculature of rabbits［J］.Br J Pharmacol，1993，110(4):1565－1571.

［4］ Sheffield WP，Eltrinqham－Smith LJ，Gataiance S，et al.A long－lasting，plasmin－activatable thrombin inhibitor aids clot lysis in vitro and does not promote bleeding in vivo［J］.Thromb Haemost，2009，101(5):867－877.

［5］ Sánchez EE，Galán JA，Russell WK，et al.Isolation and characterization of two disintegrins inhibiting ADP－induced human platelet aggregation from the venom of Crotalus scutulatus scutulatus (Mohave Rattlesnake)［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2006，212(1):59－68.